미량 및 정량 분석을 위한 나노웰어레이 바이오센서의 제작 및 평가

Abstract

전기화학 바이오센서는 사용이 편리하고, 경제적이면서도 빠르게 분석되는동시에 높은 감도와 신뢰성을 갖기 때문에 생체물질의 감지 및 분석, 독성 물질의 감별, 그리고 질병, 질환의 진단, 환경, 식품 모니터링 등 다양한 분야에서 널리 사용되고 있다. 최근에는 민감하면서도 다중 분석 및 라벨링이 필요없이 생체분자의 감지가 가능한 나노스케일의 바이오센서가 집중적으로 연구되고 있다. 특히 나노웰 어레이 바이오센서는 원하지 않는 생체 물질의 응집 및 비특이성 결합을 효과적으로 감소시킬 수 있어, 민감도가 높은 정량 분석 연구에 대안으로 제시되고 있다. 나노웰 어레이 바이오센서를 제작하는 데에 사용된 기존의 기술로는 전자빔 리소그래피, 딥펜(dip-pen) 리소그래피, 폴리머 lift-off, 소프트 리소그래피, 나노임프린트 리소그래피, 나노스피어 리소그래피, 블록공중합체 리소그래피, 아노다이징 알루미늄옥사이드 템플릿을 이용한 방법 등 다양한 제작 방법이 있다. 전자빔 리소그래피와 딥펜 리소그래피의 경우, 100 nm 이하의 패턴 제작이 가능하지만, 생산속도가 매우 낮고 통상적으로 제작되는 시편의 크기가 매우 작은 영역에 한정된다. 소프트 리소그래피와 나노임프린트 리소그래피의 경우, 대면적으로 나노 패턴을 제조할 수 있는 장점을 갖고 있지만, 추가적인 마더 스탬프가 필요하고 역시나 재현성이 낮다는 문제가 있다. 비교적 최근에 시도된 bottom-up 제조 방식인 나노스피어 리소그래피, 블록공중합체 리소그래피, 아노다이징 알루미늄 옥사이드 템플릿을 이용한 접근 방법은 매우 간단하고 경제적이지만, 역시나 작은 면적에 국한되고 나노패턴을 균일하게 조절하는 것이 쉽지 않다. 본 논문에서는 기존 방법과는 전혀 다른 혁신적인 방법으로 실리콘 옥사이드 기반의 나노웰 어레이 바이오센서를 제조할 수 있는 웨이퍼 단위(wafer-level)의 대면적 제조 공정이 개발되었다. 대면적에 나노 패턴을 균일하게 형성하기 위해 248 nm의 파장을 갖는 KrF 스텝퍼 장비를 사용하였고, 이 방법은 기존 제조 방법이 갖고 있던 신뢰성, 재현성 등의 한계를 원천적으로 해결할 수 있었다. 개발된 공정을 사용하여 6인치 웨이퍼 한장으로부터 57개의 칩을 제작할 수 있었는데, 칩 디자인을 통해 그 이상의 수량도 얼마든지 생산이 가능하다. FE-SEM, I-AFM 측정을 통해 제작된 나노웰 어레이 바이오센서의 topography와 current path image를 확인하였다. 제작된 나노웰의 지름은 500 nm, 웰과 웰의 간격과 웰의 높이는 각각 200 nm 로 측정되었다. Current path image로부터 Au 전극 위에 증착된 나노웰 구조의 구성 물질인 실리콘 옥사이드층이 완벽하게 식각된 것을 확인할 수 있었다. 전기화학적 임피던스 분광법(EIS) 및 순환전류전압법(CV)을 이용하여 제작된 칩의 전기적 특성을 분석한 결과, 나노웰 어레이 구조의 전극이 비교전극인 Bare Au 전극에 비하여 낮은 전하 이동 저항(Rct) 및 높은 이동 총 전류량(Q)을 가지는 것으로 확인되었다. 이것은 나노웰 구조를 가질 때에 더 많은 전하가 이동할 수 있고, 센싱에 직접 관여하여 분석 감도를 높일 수 있다는 이점을 의미한다. 제작된 나노웰 어레이 바이오센서의 활용성 및 적용성을 검증하기 위해 Protein 및 DNA에 대한 정량 분석 실험이 수행되었다. 첫번째로, 난소암의 바이오마커 중 하나인 STIP-1을 이용하여 EIS를 이용한 전기화학적 정량분석을 실시한 결과, 고주파 영역에서는 구분되지 않던 immunoaffinity층에 결합된 STIP-1의 농도에 따른 임피던스 값의 차이가 저주파 영역에서는 더 크게 나타났다. 또한 나노웰 어레이의 분석한계(LOD)는 bare Au 전극에 비하여 약 100배 이상 증가된 것을 확인하였다. 두번째로, 조류독감 바이러스 중 하나인 H5N1 target DNA의 정량 분석을 위해, 추가적인 증폭 과정 없이 나노웰 어레이 바이오센서를 이용하여 다양한 농도의 H5N1 target DNA에 대한 실험을 수행하였다. Target DNA와 함께 처리된 probe DNA의 표면 특성을 관찰하기 위해 AFM과 EIS를 측정한 결과, 나노웰의 높이가 200 nm 에서 15 nm 까지 감소되었는데 이것은 streptavidin과 SAM의 결합구조 위에 DNA hybridization 복합체가 나노웰 내부에 형성되었기 때문이다. 이렇게 나노웰 내부에 형성된 probe DNA와 target DNA의 결합체는 전하 이동 저항(Rct)을 증가시켰고 non-complementary DNA는 complementary DNA에 비해 무시할 정도의 수준인 매우 작은 전하 이동 저항(Rct)을 보였다. 나노웰 어레이 바이오센서를 이용한 H5N1 target DNA의 검출 한계(LOD)는 1 pM 로서, 이는 생물학 분야에 있어 높은 감도와 선택성으로 인해 매우 효과적으로 사용될 수 있는 수준이다. 위 결과들로부터, 본 논문에서 제작된 전기화학적 나노웰 어레이 바이오센서가 낮은 수준의 비특이성 결합을 유도하여 추가적인 라벨링을 필요 없게 할 뿐 아니라, 전기화학 검출 신호를 증가시킨다는 사실을 확인하였다. 나노웰 어레이 바이오센서는 낮은 농도의 검출한계(LOD) 및 높은 감도와 높은 선택성을 가지며, 아울러 경제적이면서도 뛰어난 성능을 가진다는 것을 장점으로 하여, 다양한 바이오센싱 분야에 실질적으로 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이라 예상한다.