Glioblastoma의 유전자 치료를 위한 RAGE 결합 펩타이드와 약물 봉입 전달체의 응용

Abstract

신경교모세포종은 사람에게서 나타나는 가장 악성인 형태의 뇌종양으로 종래의 치료법인 외과적 수술, 방사선 치료, 화학적 약물치료에도 불구하고 진단 받은 환자의 생존기간은 일반적으로 1-2년 정도로 짧다. 이는 정상세포와 암세포의 경계구분이 명확하지 않고 수술 후 병행하는 방사선 치료와 항암 화학요법의 부작용과 내성 등의 문제가 있기 때문이다. 신경교모세포종인 높은 등급의 신경교종에서 나타나는 특징 중 하나는 신생 혈관 생성 현상이다. 암의 급격한 성장은 저산소증 환경과 세포 괴사를 유발함과 동시에 VEGF, TNF-α와 같은 신생 혈관 생성 인자들의 발현을 유도한다. Receptor for advanced glycation end product (RAGE)는 AGE, S100/calgranulin, HMGB1, amyloid-β 등 다양한 리간드를 갖는 수용체이다. 이러한 리간드가 수용체에 결합하면 RAGE에 의한 신호 전달이 증폭되는데 이로 인해 다양한 만성 질병이 진전된다. 특히, RAGE 신호의 활성화는 암의 신생 혈관 생성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이 논문에서, 우리는 RAGE 리간드의 대항물질이 RAGE 신호를 막고 그로 인해 암의 성장을 억제할 것을 기대하여 RAGE 결합 펩타이드 (RBP)를 제작 응용하였다. 재조합체 RBP는 박테리아에서 발현되고 Nickel affinity chromatography를 이용하여 정제되었다. 우리는 HMGB1으로부터 PCR을 이용하여 RBP의 코딩 유전자를 복제하였고 Escherichia coli BL21의 형질전환을 위해 복제한 유전자를 pET-21a 벡터에 삽입하였다. IPTG induction에 의해 생산된 RBP는 Ni-NTA column을 이용하여 정제되었고 endotoxin 성분을 제거하였다. 우리는 RBP가 plasmid DNA와 정전기적 인력을 통한 결합으로 복합체를 형성함을 확인하였고, PEI 2kDa만 이용하였을 때보다 RBP를 추가하여 plasmid DNA와 복합체를 형성하였을 때 DNA 전달 효율이 더 높아짐을 확인하였다. 이는 RBP에 포함된 핵 위치 신호 (NLS)의 영향이라 예상된다. 이는 저산소증 특징을 나타내는 암 조직 환경에서 특이적인 발현이 유도되도록 제작된 pEpo-NI2-SV-TK 자살유전자를 렛 신경교모세포종인 C6세포에 전달 하였을 때 효과적으로 세포자살을 유도한 결과와 일치한다. 또한, RBP는 RAGE의 리간드인 S100B 단백질과 RAGE 결합에 대해 경쟁적으로 작용함으로써 TNF-α의 방출을 조절할 수 있었다. Glioblastoma 동물 모델에서는 RBP와 치료유전자인 HSV-TK 유전자를 이용한 복합 치료 방법은 암의 성장을 효과적이게 억제하였다. 7개의 arginine과 10개의 leucine으로 구성되어 있는 R7L10 펩타이드는 수용액상에서 스스로 마이셀을 형성할 수 있다. 이 연구에서, 우리는 R7L10을 이용하여 항암제인 Temozolomide(TMZ)와 자살 유전자인 HSV-TK 유전자를 세포 내부에 전달하는 것이 신경교모세포종 치료에 효과적임을 확인하였다. TMZ는 oil-in-water emulsion/solvent evaporation 방법을 이용하여 R7L10에 봉입하였다. TMZ가 봉입된 R7L10 (R7L10-TMZ)과 plasmid DNA가 복합체를 형성하는지 확인하기 위해 gel retardation assay를 하였고 복합체의 안정성은 heparin competition을 통해 확인하였다. Rat 신경교모세포종 세포인 C6 세포에서 R7L10-TMZ는 기존의 R7L10의 transfection 효율을 유지하였다. 또한, HSV-TK 유전자를 R7L10-TMZ를 이용하여 전달하였을 때, 다른 복합체들에 비해 가장 높은 항암효과를 나타냈다. 암세포를 이종 이식한 nude mouse model과 intracranial glioblastoma model에서 HSV-TK/R7L10-TMZ 복합체를 주입한 그룹에서 가장 효과적이게 암의 성장이 억제되었다. 이러한 결과는 HSV-TK 유전자와 TMZ를 R7L10을 이용하여 복합 전달은 효과적인 신경교모세포종 치료 방법임을 입증하였다.