Hepatitis B Virus 검출을 위한 분자 수준의 Point-of-Care Testing의 실현가능성 연구

Abstract

최근 고령화 및 웰빙 시대를 맞이하여 질병의 치료보다는 조기 진단을 통한 사전 예방의 중요성이 지속적으로 부각되고 있으며, 이를 위해 검출 장비의 높은 민감도와 정확도가 요구되고 있다. 뿐만 아니라 현장에서 바로 진단이 가능한 휴대할 수 있는 기술, point of care testing (POCT) 기술을 갖춘 소형화된 장치에 대한 개발이 요구되고 있다. 현재 분자 진단 시장은 여러 분야의 접목으로 기술적 진일보가 확연한 시장으로, 실시간 중합효소 연쇄 반응 (Real-Time PCR) 기술의 단점인 시간이 오래 걸린다는 점과, 실험 자체의 높은 난이도 등을 보완한 제품들이 속속히 개발, 출시되고 있다. 본 연구에서는 대한민국에서 가장 빈번하게 생기는 질병 중 하나인 간염에 대해서 연구하였는데, 이를 일으키는 원인 바이러스 중 제일 빈번하며 손상 정도가 제일 위험하고, 잠복기가 길어 초기 진단이 힘든 B형 간염 바이러스에 대해 연구하였다. DNA의 염기간의 상호작용을 응용하여 B형 간염 바이러스가 가지고 있는 특정 DNA 서열을 탐침 DNA를 결합시킨 금 나노 입자와 자성 입자로 잡아낼 수 있는 기술에 대해 연구하였다. 그리고 금 나노 입자를 응용하여 기타 다른 기술에 비해서 검출 원리가 간단하고 반응이 단순하며 기술 자체의 소형화를 적용하기에 적합한 전기 화학적 검출 방법을 통해 결과를 도출해내었다. B형 간염 바이러스의 진단 방법은 현재 두 가지로 구분 할 수 있다. 우선 항원-항체 반응을 이용하여 만들어진 키트에 의심되는 환자의 혈청이나 혈장에서 B형 간염 표면 항원을 검출하는 HBsAg Test가 있다. 이 방법은 매우 간단하고 검사 시간이 적게 걸린다는 장점이 있으나 측정 한계치가 높고 결과 데이터의 정확성이 다른 기술에 비해 떨어지는 편이다. 또 하나는 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (Real-time PCR)을 이용한 정밀 검사법이 있다. 이 방법은 측정 한계치가 낮고 결과가 비교적 정확하다는 장점이 있지만 검사 시간이 길고 실험의 난이도도 높은 편이라 할 수 있다. 본 연구는 분자진단에서 보편적으로 사용되는 실시간 중합효소 연쇄반응 검사 대비 검사시간을 최대 60%를 단축하고, 측정 한계치의 수준을 현재 상용화 되어있는 항원-항체 상호작용을 통한 급속 진단 키트에 비해 낮추면서 검사 방법이 비교적 간단한 실험 과정을 갖는 기술을 개발하는 것을 목표로 하였다. 본 연구는 크게 네 가지의 단계로 구성이 되어있다. 우선 ①B형 간염 바이러스가 개체를 감염시키는 데에 필수적인 역할을 하는 S 단백질을 암호화 하고 있는 S gene의 서열 중에서 모든 아종들이 공통으로 가지고 있는 서열 (82bp)을 검출하고자 하는 타겟으로 선정하였다. 그리고 ②준비된 금 나노 입자와 자성 입자에 위의 타겟의 양 끝에 혼성화 될 수 있는 형광(각각 FAM, Cy3)이 달린 탐침 DNA를 제작하여 각각 결합시킨다. 그리고 ③타겟 DNA를 넣어주어 금 나노 입자와 자성 입자에 결합하여 bridge를 형성하는지를 형광 측정기를 통하여 확인한다. ④ 마지막으로 형성된 bridge-formation이 silver enhancement 과정을 거친 후, 전기 화학 측정 장비를 통하여 전기 저항(resistance)를 측정함으로써 B형 간염 바이러스의 DNA를 검출한다. 본 연구의 결과, 금 나노 입자와 자성 입자에 각각 탐침 DNA를 결합하는 데 있어 최적인 조건을 제시할 수 있었다. 이렇게 만들어진 금 나노 입자-탐침 DNA 복합체, 자성 입자-탐침 DNA 복합체와 B형 간염 바이러스 DNA의 타겟 부분을 일정한 환경에서 섞어주어 bridge를 형성하게 한 후 silver enhancement를 통해 전기 저항의 변화를 30분간 측정한 결과, 10pg/mL의 측정 한계치를 가지는 기술의 가능성을 제시할 수 있었다. 현대 사회는 질병의 조기 진단을 위한 검출 장비의 고감도와 정확성뿐만 아니라 휴대성을 갖춘 질병 진단용 마이크로 칩 개발이 요구하고 있다. B형 간염 바이러스뿐 만 아니라 특정 염기 서열을 갖는 DNA의 검출이 가능한 포맷의 기술로서 좀 더 축소화 및 측정 기준치에 대한 실험의 재현성에 관한 결과가 확보된다면 다양한 병원성 질병이나 유전성 질병을 현장에서 진단하는 것이 가능한 최신 기술의 개발이 가능할 것이다. |Recently people have become more focused on their personal health, placing more attention on self and early diagnostics. Early diagnostics values and the probability of full recovery of a number of human diseases have increased, as researchers have studied new diagnostic methods for human diseases. Self-diagnostics, prior to hospital diagnostics, are an emerging trend, which use integrated biotechnology techniques and new diagnostic machines and methods. Hepatitis B is an infectious disease caused by the hepatitis B virus (HBV) which affects the liver. Infection with hepatitis B virus is associated with acute viral hepatitis-an illness that begins with abdominal pain, dark urine, fever, joint pain, loss of appetite, nausea, vomiting, weakness and fatigue and then progresses to development of jaundice. The genome of HBV made of partial double strands circular DNA, is found in the nucleus soon after infection of the cell, so it is practicable to molecular diagnosis. Usually, real-time PCR-based methods have been used to diagnose HBV infection by amplifying HBV DNAs and measuring an amount of them. Thus they require expensive PCR machines that is not portable and complicated procedures including design of primer sets and specific probes. We designed a non-amplification method to detect HBV DNA using two dual-labelled probes each conjugated by gold nanoparticles (GNP) and magnetic particles (MP), that are partly complementary to HBV DNA. GNP probe and MP probe make a bridge formation with HBV DNA for molecular competitive assay. We used magnetic particles for washing and collecting non-amplified DNA partly conjugated gold nanoparticles. Then, gold nanoparticles, which are widely used for the detection of template DNA by DNA-functionalized, play a role in detecting signal amplification by silver enhancement. This signal amplification method has a more advantage of reducing running time, and simplifying experiment procedure than PCR-based amplification methods. We establishment experimental conditions to use bridge formation for detecting Hepatitis B Virus DNA. Using this technique, GNP can be detected by silver enhancement using electrochemistry, it can detect about 10pg/mL of HBV DNA. Our detection method can be applied to Point-of-Care (POC) not only for an early detection of specific and different disease, but for a good accessibility to diagnosis, at once. If this system integrates and minimizes more, it can be possible to decrease limit of detection (LOD), total running time and to give a high stability for point-of-care testing (POCT).; Recently people have become more focused on their personal health, placing more attention on self and early diagnostics. Early diagnostics values and the probability of full recovery of a number of human diseases have increased, as researchers have studied new diagnostic methods for human diseases. Self-diagnostics, prior to hospital diagnostics, are an emerging trend, which use integrated biotechnology techniques and new diagnostic machines and methods. Hepatitis B is an infectious disease caused by the hepatitis B virus (HBV) which affects the liver. Infection with hepatitis B virus is associated with acute viral hepatitis-an illness that begins with abdominal pain, dark urine, fever, joint pain, loss of appetite, nausea, vomiting, weakness and fatigue and then progresses to development of jaundice. The genome of HBV made of partial double strands circular DNA, is found in the nucleus soon after infection of the cell, so it is practicable to molecular diagnosis. Usually, real-time PCR-based methods have been used to diagnose HBV infection by amplifying HBV DNAs and measuring an amount of them. Thus they require expensive PCR machines that is not portable and complicated procedures including design of primer sets and specific probes. We designed a non-amplification method to detect HBV DNA using two dual-labelled probes each conjugated by gold nanoparticles (GNP) and magnetic particles (MP), that are partly complementary to HBV DNA. GNP probe and MP probe make a bridge formation with HBV DNA for molecular competitive assay. We used magnetic particles for washing and collecting non-amplified DNA partly conjugated gold nanoparticles. Then, gold nanoparticles, which are widely used for the detection of template DNA by DNA-functionalized, play a role in detecting signal amplification by silver enhancement. This signal amplification method has a more advantage of reducing running time, and simplifying experiment procedure than PCR-based amplification methods. We establishment experimental conditions to use bridge formation for detecting Hepatitis B Virus DNA. Using this technique, GNP can be detected by silver enhancement using electrochemistry, it can detect about 10pg/mL of HBV DNA. Our detection method can be applied to Point-of-Care (POC) not only for an early detection of specific and different disease, but for a good accessibility to diagnosis, at once. If this system integrates and minimizes more, it can be possible to decrease limit of detection (LOD), total running time and to give a high stability for point-of-care testing (POCT).