Plasma gelsolin이 적아구의 성숙에 미치는 영향 연구

Abstract

Gelsolin (GSN)은 액틴 결합 단백질로서, 세포의 운동성 및 형태 형성 조절에 관여하며 혈액 내 혈장과 여러 세포에 광범위하게 존재한다. 하지만 사람의 적아구에서 GSN의 역할에 대해서는 알려져 있지 않다. 본 연구에서는 사람의 제대혈로부터 조혈모세포 (CD34+ 세포)를 분리하여 무혈청 액상배지에서 배양하면서 human recombinant plasma GSN (pGSN) 단백질을 첨가하여 적아구의 분화 단계별로 성숙에 대한 효과 및 세포 이형성증과 관련된 pGSN의 역할을 규명하고자 하였다. 조혈모세포를 호염기적아구 (basophilic erythroblast)와 다염성적아구 (polychromatic erythroblast)로 분화시킨 후 pGSN을 24시간과 48시간 동안 배지에 첨가하여 세포의 형태학 변화를 Wright-Giemsa 염색을 통하여 관찰하였다. 또한 유세포 분석기로 적혈구 세포 표면 표지자 발현을 측정하여 세포의 순도 및 성숙 정도를 확인하였다. pGSN이 적아구의 분자생물학적 기전에 관여하여 성숙을 촉진시키는지 qRT-PCR로 mRNA 발현을 확인하였다. 또한 pGSN이 비정상적인 세포질 분열 현상인 세포 이형성증을 개선시키는지 propidium iodide 염색을 통하여 분석하였다. 적아구의 G2/M checkpoint에 작용하는 pGSN의 기전을 검증하기 위해 호염기적아구 및 다염성적아구에 세포유사분열 중기에 작용하는 유사분열저해제인 vincristine (VCR)으로 G2/M기 억류 (arrest)를 유도하여 세포 이형성증을 유발시킨 세포에 pGSN을 처리하여 세포주기 조절을 통해 세포 이형성증을 개선하는지 실험하였다. 그 결과 호염기적아구 및 다염성적아구의 pGSN 처리군에서 대조군에 비해 성숙한 세포와 탈핵률이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 세포 이형성증이 낮은 비율로 나타나는 호염기적아구에서 pGSN에 따른 세포 이형성증은 차이가 크지 않았지만, 다염성적아구의 pGSN 처리군에서는 대조군에 비해 pGSN 농도 의존적으로 세포 이형성증이 감소하였다. 또한 pGSN 처리시 호염기적아구에서 세포표면 표지자인 CD44+의 발현이 감소되어 세포가 성숙되었음을 확인하였다. 또한 적혈구계 세포의 특이적 전사인자인 GATA-1, 적혈구 세포에서 성숙에 따라 증가하는 접착관련 유전자인 VLA-4 (Very Late Antigen-4), ICAM-4 (intercellular adhesion molecule-4), DLC-1 (deleted in liver cancer-1)과 액틴 세포골격을 조절하는 RhoA (small GTPase Ras homolog gene family, member A)의 mRNA 발현이 대조군에 비해 pGSN 처리군에서 높게 나타났다. 특히 호염기적아구 pGSN 2.0 μM에서 48시간 처리 후 GATA-1 (1.97배), ICAM-4 (3.72배), DLC-1 (2.20배)의 mRNA 발현과 다염성적아구 pGSN 2.0 μM에서 24시간 처리 후 DLC-1 (2.27배)의 mRNA 발현이 대조군에 비해 통계학적으로 유하게 증가하여 pGSN이 세포의 성숙 관련 유전자 발현을 증가시킴을 확인하였다 (*p<0.05). 호염기적아구의 pGSN 처리군에서는 세포주기 중 G0/G1기가 유의하게 증가하고 S, G2/M기가 유의하게 감소하여 pGSN이 적아구의 세포주기에 관여함을 밝혔다 (*p<0.05). 또한 vincristine (VCR)을 처리하여 G2/M기를 저해 (block) 시키는 실험에서 pGSN 처리군이 세포주기 억류로 인해 증가하였던 G2/M기가 줄어들고 G0/G1기가 다시 늘어나 pGSN이 비정상적 세포주기 억류를 개선할 수 있음을 확인하였다. 위 결과를 통해 조혈모세포에서 유래한 적아구가 분화할 때 pGSN이 적아구의 성숙과 탈핵 및 세포주기에 미치는 영향을 처음으로 확인하였으며, G2/M checkpoint에 작용하여 비정상적인 세포분열을 개선하고 세포 이형성증을 줄이는 기전을 밝혔다. 결론적으로 pGSN을 응용하여 향후 적혈구 세포 이형성증을 가진 환자를 위한 치료제 개발 또는 임상적용 가능한 적혈구 체외 생성에 있어서 세포의 성숙과 세포 이형성증을 더 효율적으로 개선시키는 인자로 사용될 수 있을 것이다.