재조합 대장균을 통한 EBPylated Exenatide 융합 단백질 발현

Abstract

Polyethylene glycol(PEG)는 비활성 생체재료 고분자로서 펩타이드 또는 단백질들의 기능성 개선을 위한 수식(modification) 과정에 널리 사용되어 왔다. 하지만 활성화 PEG는 세포발현을 통해 발현되지 못하므로 정제된 단백질 표면의 화학적 수식 (chemical modification) 과정을 거쳐야 하기에 많은 단점을 가지고 있다. 최근 비활성(inert) 엘라스틴 기반 폴리펩타이드 (EBP: Elastin-Based Polypeptide)가 생체적합성 및 자극반응성 (stimuli responsiveness)을 가진 흥미로운 차세대 바이오 물질로 떠오르고 있다. 본 연구에서는 PEG를 대체하기 위해 엘라스틴 기반의 비활성 폴리펩타이드(EBP)를 제안한다. EBP는 생체 고분자 물질로 Val-Pro-Gly-Xaa-Gly (VPGVG)의 5개의 아미노산이 반복되는 pentapeptide로 Xaa의 자리에는 proline을 제외한 모든 아미노산이 들어갈 수 있다. 친수성/소수성의 최적 비율, 최적 분자량 및 생체적합성을 갖춘 최적의 EBP를 선정한 후 선정된 EBP를 파트너 도메인으로 하여 고안정성 저면역성의 융합단백질을 재조합 대장균으로부터 유전자발현을 통해 직접 구현하는 기반공정으로서 “EBPylation" 공정을 구축하고자 하였다. 목적 단백질로는 Exenatide를 선택하였다. Exenatide는 39개의 아미노산으로 구성된 펩타이드로 제2형 당뇨병 치료제이며 Gila monster 도마뱀의 타액에서 유래되었다. 선정된 EBP와 Exenatide를 유전학적으로 수식하여 Exenatide-EBP 융합단백질을 제작하였다. 제작된 Exenatide-EBP 융합단백질을 재조합 E. coli로부터 발현되었다. 융합단백질 발현을 극대화하기 위해 최적의 발현 벡터, 숙주세포, 세포 배양 배지를 선택하기 위한 실험들을 진행하였다. 그 결과로 발현 벡터로는 pET23a(+) 벡터, 숙주세포로는 BL21(DE3)pLysS 그리고 세포 배양 배지로는 circle grow® 배지가 선정되었다. 발현된 융합단백질은 immobilized metal ion affinity chromatography(IMAC)에 의해 초기분리 하였으며, 분리된 융합단백질을 SDS-PAGE와 His-tag in gel staining으로 확인하였다.