자성입자 기반의 분변 핵산 추출을 위한 미세유로카트리지와 운용시스템의 개발

Abstract

핵산 추출은 분자생물학 연구 및 분자진단의 첫 번째 단계이며, 핵산 추출의 수율 및 순도가 후속 단계의 결과에 영향을 미치는 매우 중요한 단계이다. 분변을 대상으로 한 핵산 추출 과정은 다른 검체에 비해 복잡하며, 더 많은 과정과 시간이 필요하여 자동화하기 어렵다. 게다가 많은 불순물과 저해물질의 존재로 인해 높은 수율과 순도로 핵산을 추출하는 것도 쉽지 않다. 그러므로, 분변 검체로부터 높은 수율과 순도로 핵산을 추출하면서, 그 과정이 자동화되어 분자진단 POCT에 적용이 가능할 정도로 간단한 핵산 추출법의 개발이 분변을 대상으로 한 연구 및 임상에서의 분자진단 활성화에 필수적이다. membrane column 방식 등 다양한 핵산 추출 기술이 개발되고 있으나, 현재까지 알려진 바로는 자성입자 기반의 핵산 추출법이 자동화에 가장 적합하다. 반면에 많은 불순물과 저해물질의 제거를 위해 필수적인 분변전처리 단계는 vortexing, bead beating 등 물리적인 처리가 필요하여 자동화에 적용하기 적절치 않아 자동화에 적용하기 위한 방법적 개선이 필요한 실정이다. 본 연구에서는 간단한 전처리 방법을 포함한 자성입자 기반의 분변 핵산 추출 방법을 개발하였다. 개발된 핵산 추출 방법을 임상 분변 검체를 대상으로하여 상용화된 핵산 추출 시약인 QIAamp® DNA Stool Mini kit과 비교하고 성능 평가를 실시하였다. 개발된 핵산 추출 방법은 수작업 시간 및 수작업 단계가 적고, 결과를 신속하게 확인할 수 있음으로 인해 상용제품에 비해 우수한 사용자 편리성을 보유하고 있음을 확인하였다. 성능의 측면에서도 개발된 핵산 추출 방법은 상용 제품 대비 높은 수율을 보였고, 순도에서는 동등 수준을 유지하였다. 임상 병원체의 검출 능력 측면에서도 상용 제품과 동등 수준의 성능을 보였고, 표준검사법 대비 동등 이상의 우수한 결과를 보였다. 일부 저해 물질에 의해서 영향을 받는 결과를 포함하였지만, 재현성, 직선성, 검출 한계, 검체에 포함된 물질 조성에 따른 영향 여부(matrix effect)와 같은 성능 시험에서 임상 검사를 목적으로 하여 일상적으로 사용이 가능함을 확인하였다. 추가적으로, 개발된 분변 핵산 추출 방법을 이용하여 완전자동화된 분변 핵산 추출 미세유로카트리지 및 운용 시스템을 개발하였다. Sample pre-treatment, lysis/binding, washing 그리고 elution을 포함한 모든 과정이 미세유로카트리지에 구현되어 최소한의 수작업만 필요한 상태로 구동이 가능함을 확인하였다. 미세유로카트리지의 성능을 분변 검체 안에 존재하는 박테리아, 바이러스 및 microbiome을 대상으로 하여 상용 제품과 비교하여 검증하였다. 미세유로카트리지는 상용제품 대비 추출된 핵산의 수율과 순도에서 동등 수준이상의 결과를 보였으며, microbiome diversity 측면에서도 동등 수준 이상의 다양성을 보였다. 본 연구에서 개발된 핵산 추출 방법과 미세유로카트리지는 장내 병원체를 대상으로 하여 간단하면서 신속한 진단을 위한 분자진단 POCT의 개발과 장내미생물에 대한 microbiome analysis를 위한 핵산 추출 제품 개발에 중요한 기반이 될 수 있을 것이다.