Therapeutic applications of exosomes derived from human adipose stem cells for cancer and osteoporosis

Abstract

In recent decades, stem cell therapy has received a lot of attention as a tissue-regenerative medicine. Among them, mesenchymal stem cells (MSCs) have attracted much attention for tissue regeneration, since it is relatively abundant and its ability to differentiate into mesodermal linages such as adipocytes, bone, cartilage. However, recent studies have shown that the survival rate of transplanted cells is extremely low. In addition, the therapeutic effect of stem cell therapy is not due to the stem cell differentiation or tissue replacement but due to the paracrine factors secreted from stem cells.

Exosomes are known as one of the main factors secreted from stem cells. Stem cell-derived exosomes are the extracellular vesicles that have received most attention as cell-to-cell communication mediators as they transfer proteins, lipids, and genetic materials into adjacent cells. Stem cell-derived exosomes have shown promising therapeutic effects for a variety of disease that have been tried in stem cell therapy. In this study, exosomes derived from human adipose stem cells (hASCs) are proposed as a novel cell-free regenerative medicine. Exosomes were isolated through serial filtration steps including tangential flow filtration (TFF) system.

In chapter 2, exosomes derived from hASCs during osteogenic differentiation (OD-EXO) are applied to cancer stem cell (CSC) reprogramming. CSCs are known to a key player for cancer initiation, progress, metastasis, drug resistance and relapse. OD-EXOs contain cargos related to osteogenic differentiation including proteins, growth factors, and nucleic acids, which could induce osteogenic differentiation and stemness attenuation of osteosarcoma cancer stem cell (CSC). Quantitative RT-PCR analysis revealed that the OD-EXO enhanced expression of osteogenesis related genes such as alkaline phosphatase (ALPL), osteocalcin (BGLAP), and runt-related transcription factor 2 (RUNX2). Indeed, Quantitative RT-PCR array revealed that OD-EXO significantly suppress important genes involved in cancer drug resistance such as ATP binding cassette (ABC) transporter, breast cancer gene family (BCRA1 and BCRA2), and ErbB gene family. Overall results suggest that OD-EXO reprograms CSCs into non-tumorigenic cells by delivering various bioactive molecules that could induce differentiation.

In chapter 3, exosomes derived from proliferating hASCs (P-EXO) for osteoporosis treatment is introduced. Stem cell exosomes contain many factors such as proteins and genetic materials (mRNA, ncRNA and miRNA etc.) related to cellular proliferation and differentiation. Cytokine array revealed that osteoprotegerin (OPG), known as osteoclastogenesis inhibitory factor, is one of the major component of P-EXOs. Tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) staining and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) exhibited that P-EXOs have inhibitory effect on osteoclast differentiation of macrophages. Trasnwell migration assay showed the migration inducing ability of P-EXOs. In vivo experiments revealed that the intravenous injection of P-EXOs attenuates bone loss in ovariectomized (OVX) mice. Overall results suggest that diverse components including OPG enriched in P-EXOs could act as a biochemical cue for bone recovery from postmenopausal osteoporosis.

|본 연구는 지방유래 줄기세포로부터 분비되는 엑소좀을 이용하여 골 질환 치료에 응용할 수 있는 무세포 치료 시스템을 개발하는 것을 목표로 한다. 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖고 있는 ‘줄기세포'는 재생의학 및 난치성 질환의 치료제로 각광받고 있다. 최근 연구에 따르면 줄기세포의 치료 효능이 투여된 줄기세포의 자체 분화에 의한 것 보다는, 줄기세포가 분비하는 분비물에 의해 발생한다고 알려져 있다. 한편, 줄기세포 치료제는 줄기세포의 체내 생존율이 매우 낮으며, 분화되지 못하거나 비정상적으로 자란 세포로 인한 암 발생, 독성 등 안전성 문제가 대두되고 있다. 따라서 줄기세포를 직접 체내에 주사하는 줄기세포 치료제의 대체 치료 방법으로서 줄기세포가 분비하는 분비물을 이용하는 무세포 치료 시스템(cell-free therapeutic system)이 각광받고 있다.

줄기세포 분비물 내에는 나노 사이즈의 소포체인 ‘엑소좀’이 포함되어 있다. 엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 인지질이중막으로 이루어져 있으며, 내부에는 유래된 세포의 상태를 반영하는 단백질, 인지질, 유전물질 등이 포함되어 있다. 엑소좀은 세포 간 신호전달 매개체로서 이러한 정보를 다양한 세포로 전달하여 세포의 성장, 이동, 분화, 사멸을 포함한 세포 거동을 조절한다고 알려져 있다. 본 연구에서는 줄기세포로부터 추출한 엑소좀을 이용하여 골 암 줄기세포의 리프로그래밍 및 골다공증 치료제로서의 적용 가능성을 확인하였다.

첫 번째 연구에서는 골세포로 분화하는 줄기세포 유래 엑소좀을 이용하여 골 암 세포 내 암줄기세포의 분화 및 리프로그래밍을 유도하는 연구를 진행하였다. 암 조직 내에는 다양한 형질의 암세포가 존재하며 특히 암줄기세포로 불리는 세포가 존재한다. 암줄기세포는 줄기세포와 비슷한 특징(자가복제, 분화, 약물저항성 등)을 가지며, 약물저항성에 의해 암치료 후 암세포의 잔존 및 재발을 유도하는 암세포로 알려져 있다. 본 엑소좀 내에는 골세포로의 분화를 촉진시키는 인자가 다양하게 존재하여 암줄기세포를 약물저항성이 약화되고 더욱 분화된 형태의 암세포로 리프로그래밍 시킬 수 있을 것이라고 가설을 세우고 연구를 진행하였다.

세포 내 흡수 및 WST-1 분석 결과, 줄기세포 유래 엑소좀이 독성 없이 세포 내로 효율적으로 흡수됨을 확인하였다. 또한, 엑소좀의 암 줄기세포 분화를 관찰하기 위해 골암세포주에서 암 줄기세포를 추출하였다. 추출한 암 줄기세포는 골암 세포에 비해 줄기세포 관련 유전자가 현저히 높게 발현됨을 확인하였다. 2주간의 분화 유도 엑소좀 처리 후 암 줄기세포에서는 골분화와 관련된 유전자가 발현되었다. 또한, 유전자 스크리닝을 통해 엑소좀 처리군에서 골 분화 관련 유전자군의 발현 증가와 약물 저항성 관련 유전자군의 발현 저하를 관찰할 수 있었다. 이상의 연구결과를 통하여 골세포로 분화하는 줄기세포 유래 엑소좀은 골암세포주 내의 암줄기세포의 리프로그래밍을 촉진하여, 암줄기세포의 분화를 유도하며 최종적으로 약물저항성을 낮춰 약물저항성 암 치료제로 적용될 수 있음을 확인하였다.

두 번째 연구에서는 증식하고 있는 줄기세포 유래 엑소좀을 이용하여 골다공증 치료제로 적용하는 연구를 진행하였다. 골다공증은 폐경 후 여성들에게 나타나는 제1형 골다공증과 노인성 질환인 제 2형 골다공증으로 나뉘며, 50세 이상 성인 중 55%가 골다공증을 앓고있다. 그러나 외부로 나타나는 증상이 없어 인지율이 떨어지고, 병이 진행 된 이후 낙상 등의 사고에 의한 골절로 병을 인지하는 경우가 많다. 현재 골다공증 치료제는 비스포스포네이트 계열 약물이 주도하고 있으며, 에스트로겐 수용체 조절제, 부갑상선호르몬 계열 등이 있다. 하지만 비스포스포네이트 경구 제제의 경우 고용량 경구제나 정맥주사 시에는 발열 등의 급성 반응을 유발할 수 있으며, 저칼슘혈증, 신기능 저하 환자에게는 투여에 제한이 있다. 따라서 부작용의 위험은 최소화 하면서, 근본적으로 골재생을 유도할 수 있는 치료제의 개발이 필요한 실정이다.

사이토카인 어레이 분석을 통해 추출된 엑소좀 내부의 유효 인자를 분석한 결과, 파골세포의 분화 및 활성을 억제하는 사이토카인과 중간엽 줄기세포의 세포 이동을 유도하는 사이토카인들이 함유되어있는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 파골세포의 분화를 억제하는 사이토카인인 Osteoprotegerin (OPG)이 다른 사이토카인들에 비해 현저히 높게 발현되었다. 세포 실험을 통해 엑소좀이 파골세포의 분화를 억제시키며 중간엽 줄기세포의 세포 이동을 촉진시키는 것을 확인하였다. 또한 제1형 골다공증 모델인 난소적출모델 실험동물을 통해 2주간의 엑소좀 투여가 골밀도를 증가시키고 최종적으로 골다공증을 완화시킨다는 것을 확인하였다.; In recent decades, stem cell therapy has received a lot of attention as a tissue-regenerative medicine. Among them, mesenchymal stem cells (MSCs) have attracted much attention for tissue regeneration, since it is relatively abundant and its ability to differentiate into mesodermal linages such as adipocytes, bone, cartilage. However, recent studies have shown that the survival rate of transplanted cells is extremely low. In addition, the therapeutic effect of stem cell therapy is not due to the stem cell differentiation or tissue replacement but due to the paracrine factors secreted from stem cells.

Exosomes are known as one of the main factors secreted from stem cells. Stem cell-derived exosomes are the extracellular vesicles that have received most attention as cell-to-cell communication mediators as they transfer proteins, lipids, and genetic materials into adjacent cells. Stem cell-derived exosomes have shown promising therapeutic effects for a variety of disease that have been tried in stem cell therapy. In this study, exosomes derived from human adipose stem cells (hASCs) are proposed as a novel cell-free regenerative medicine. Exosomes were isolated through serial filtration steps including tangential flow filtration (TFF) system.

In chapter 2, exosomes derived from hASCs during osteogenic differentiation (OD-EXO) are applied to cancer stem cell (CSC) reprogramming. CSCs are known to a key player for cancer initiation, progress, metastasis, drug resistance and relapse. OD-EXOs contain cargos related to osteogenic differentiation including proteins, growth factors, and nucleic acids, which could induce osteogenic differentiation and stemness attenuation of osteosarcoma cancer stem cell (CSC). Quantitative RT-PCR analysis revealed that the OD-EXO enhanced expression of osteogenesis related genes such as alkaline phosphatase (ALPL), osteocalcin (BGLAP), and runt-related transcription factor 2 (RUNX2). Indeed, Quantitative RT-PCR array revealed that OD-EXO significantly suppress important genes involved in cancer drug resistance such as ATP binding cassette (ABC) transporter, breast cancer gene family (BCRA1 and BCRA2), and ErbB gene family. Overall results suggest that OD-EXO reprograms CSCs into non-tumorigenic cells by delivering various bioactive molecules that could induce differentiation.

In chapter 3, exosomes derived from proliferating hASCs (P-EXO) for osteoporosis treatment is introduced. Stem cell exosomes contain many factors such as proteins and genetic materials (mRNA, ncRNA and miRNA etc.) related to cellular proliferation and differentiation. Cytokine array revealed that osteoprotegerin (OPG), known as osteoclastogenesis inhibitory factor, is one of the major component of P-EXOs. Tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) staining and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) exhibited that P-EXOs have inhibitory effect on osteoclast differentiation of macrophages. Trasnwell migration assay showed the migration inducing ability of P-EXOs. In vivo experiments revealed that the intravenous injection of P-EXOs attenuates bone loss in ovariectomized (OVX) mice. Overall results suggest that diverse components including OPG enriched in P-EXOs could act as a biochemical cue for bone recovery from postmenopausal osteoporosis.