Basal-type Lumenogenesis and Organogenesis by Extraembryonic Endoderm Stem Cells Models the Visceral Endoderm

Abstract

Tight junction protein 1, Zo1) markers, which showed apical polarity outside and basal polarity inside. In addition, pXEN cells showed an intrinsic tendency toward vacuolation by inhibition of collagen results, it appears that cell-matrix interaction is the key point. Finally, we showed the vesicles is similar to that of the early VE at the egg cylinder stage of development.

Second, we focused the matrix-embedded organoids. Matrigel-embedded organoids showed the reverse polarity compared to the floating vesicles. Compared to the floating vesicles, they often appeared similar to aggregates and clear lumina were rarely seen but exhibited thicker epithelia than seen in the floating vesicles by Cdh1, f-actin markers. Moreover, the alpha fetoprotein (Afp), Apolipoprotein B (ApoB), and Dolicho's biflorus agglutinin (DBA) marker showed that the matrix-embedded organoids exhibited a high degree of VE-like differentiation, actually higher than seen with the floating vesicles. Finally, we also assessed a spectrum of markers that are associated with the functions of the yolk sac in nutrition and potentially in pharmacology.

Taken together, the ability to obtain alternatively polarized organoids for the same tissue opens interesting analytical possibilities, but so far characterization of the matrix-embedded organoids is less advanced than that of the free-floating vesicles. Further optimization and direct comparisons of the two systems will be needed in order to decide which one is best for the ultimate purpose of this work: To create an in vitro system that is suitable to study yolk sac functions under scalable, controlled conditions in vitro.

|이 논문의 주제는 원시 내배엽 (PrE)으로부터 난황낭의 실질 구성 조직인 내장 내배엽 (VE)으로 분화되는 배외 내배엽 계통에 대한 연구이다. PrE와 VE에 대한 연구는 배아 패터닝, 영양, 원시 조혈, 그리고 어쩌면 약물 수송과 신진 대사와 같은 기능 등 복합적인 난황낭의 기능을 이해하기 위해 중요하다. 비록 난황낭에 대해 연구되어 밝혀진 내용들은 대부분 내 연구에서도 사용되어진 설치류에서 진행되었으나 이 모델에서 얻어진 많은 이해와 통찰력들은 인간의 태아기 의학에 적용하기에 유사한 부분이 많다.

최근 줄기 세포 유래 오가노이드는 전통적인 2D 배양보다 더욱 현실적인 환경에서 조직의 기능을 연구하는데 점점 유용해지고 있다. 이 접근법은 줄기 세포의 자기 조직 능력을 이용하면서도 확장성과 유전자적 유연성을 포함하고 있다. 이 학위논문 연구에서, 우리는 원시 배외 내배엽 (pXEN) 유사 줄기 세포라고 하는 랫 PrE 유사 줄기 세포를 이용하여 오가노이드를 만들고 그들의 발생에 대해 연구를 진행하였다.

첫번째는, 자유롭게 떠다니는 부유 오가노이드에 대해 연구를 진행하였다. 우리들은 혈청 및 GSK3b 억제제 인 Chir99021에 의해 세포 내에 vacuole이 유도 및 확대되는 것을 확인하였으며, 이 vacuole은 약 알칼리성 pH를 나타내고, macropinocytosis에 의해 발생되며, 원형질막으로부터 직접 유래됨을 발견하였다. Vacuole 형성이 세포주기의 G2 단계에서 더 이상의 진행을 방해하더라도, 적절하게 세포의 배양 밀도를 조절하면 다세포로 구성된 vesicle의 형성을 가능하게 하며, 이 단계를 우리는 "3-cell stage"라고 하였다. 일단 vesicle이 형성되면, 초기에는 vacuole이 macropinocytosis에 의해 발생하는 것과 동일하게 vesicle에서도 transcytosis에 의해 빠르게 성장하게 된다. Vesicle lumenogenesis의 기본 원리는 apical-out 극성과 basal-inside 극성을 보여주는 마커인 Pdxl (apical), Na/K ATPase (basal), Cdh1 and Zo1 (epithelial)의 발현으로 확인할 수 있다. 또한, 콜라겐 억제 실험결과를 통해 pXEN 세포는 본질적으로 vacuole을 형성하려는 경향이 있음을 확인하였으며, 이는 세포-matrix 간의 상호작용이 vacuole형성의 핵심 포인트임을 보여준다. 마지막으로, 우리는 vesicle이 배아 발달기에서 egg cylinder 단계의 초기 VE와 유사함을 보여주었다.

두번째로는, 오가노이드가 matrix 내에 embed된 형태로 진행된 연구이다. 이렇게 matrix의 한 종류인 Matrigel에 embed된 오가노이드는 이전의 부유 오가노이드와 다르게 반대의 극성을 나타냈다. 부유 오가노이드와 비교해서, Matrigel-embed된 오가노이드들은 종종 응집체처럼 보였고, 오가노이드 내 공간 형성이 드물게 발생되었으나, Cdh1과 F-actin 마커를 사용하여 부유 오가노이드보다 두껍게 형성된 상피조직을 확인할 수 있었다. 더욱이, Afp, ApoB 및 DBA 마커는 matrix-embed 오가노이드가 부유 오가노이드보다 실제로 높은 VE-유사 분화를 나타냄을 보여주었다. 마지막으로 우리는 잠재적으로 영양학 그리고 약리학적 측면에서 난황낭 기능과 연관되어 있는 다양한 마커에 대한 연구를 진행하고 이를 평가했다.

종합하면, 동일한 조직에 대해 대조적 극성을 보이는 오가노이드를 얻는 능력은 흥미로운 분석 가능성을 열어 주지만, 지금까지 matrix-embed된 오가노이드의 특성화 분석은 자유 부유 오가노이드보다 부족하다. 그리고 이 연구의 최종 목적인 체외에서 확장 가능하고 제어된 조건에서 난황낭의 기능을 연구하기에 적합한 체외 시스템의 구축에 가장 적합한 시스템을 결정하기 위해 두 시스템을 추가로 최적화하고 직접 비교해야 할 필요성이 대두된다.; Tight junction protein 1, Zo1) markers, which showed apical polarity outside and basal polarity inside. In addition, pXEN cells showed an intrinsic tendency toward vacuolation by inhibition of collagen results, it appears that cell-matrix interaction is the key point. Finally, we showed the vesicles is similar to that of the early VE at the egg cylinder stage of development.

Second, we focused the matrix-embedded organoids. Matrigel-embedded organoids showed the reverse polarity compared to the floating vesicles. Compared to the floating vesicles, they often appeared similar to aggregates and clear lumina were rarely seen but exhibited thicker epithelia than seen in the floating vesicles by Cdh1, f-actin markers. Moreover, the alpha fetoprotein (Afp), Apolipoprotein B (ApoB), and Dolicho's biflorus agglutinin (DBA) marker showed that the matrix-embedded organoids exhibited a high degree of VE-like differentiation, actually higher than seen with the floating vesicles. Finally, we also assessed a spectrum of markers that are associated with the functions of the yolk sac in nutrition and potentially in pharmacology.

Taken together, the ability to obtain alternatively polarized organoids for the same tissue opens interesting analytical possibilities, but so far characterization of the matrix-embedded organoids is less advanced than that of the free-floating vesicles. Further optimization and direct comparisons of the two systems will be needed in order to decide which one is best for the ultimate purpose of this work: To create an in vitro system that is suitable to study yolk sac functions under scalable, controlled conditions in vitro.; The subject of this thesis is the extraembryonic endoderm lineage, which starts with the primitive endoderm (PrE) and then generates the visceral endoderm (VE), the parenchymal component of the yolk sac. Study of PrE and VE is important in order to understand the multiple yolk sac functions, such as embryonic patterning, nutrition, primitive hematopoiesis, and probably drug transport and metabolism. Although most of what is known about the yolk sac was discovered in rodents, which also are the model in my work, many of these insights are likely relevant for human prenatal medicine.

Recently stem cell-derived organoids have become increasingly useful for studying tissue functions in a more realistic setting than traditional 2D cultures. This approach exploits the self-organizing capacity of stem cells while also offering scalability and genetic malleability. In my thesis work, we have used rat PrE-like stem cells named primitive extraembryonic endoderm (pXEN) cells in order to create organoids and study their genesis.

First, we studied the free-floating organoids. We found that serum and the Glycogen synthase kinase 3 (GSK3b) inhibitor, Chir99021 (Chir), both induced and enlarged the vacuoles, which exhibit a slightly alkaline pH and were fed by macropinocytosis, and directly derived from the plasma membrane. Even though vacuoles disrupted the cell cycle in the G2 stage, appropriate cell density allowed the formation of multicellular vesicles, which we call “triple-cell stage”. Once formed, the nascent vesicles rapidly grew and be fed by transcytosis, likely driven by the same macropinocytosis that had fed the vacuoles. The principal mechanism of vesicle lumenogenesis was revealed by apical (podocalyxin, Pdxl), basal (Na/K ATPase), and epithelial (E-cadherin, Cdh1