생쥐 Sertoli cell에서 miR-25-3p에 의한 혈액정소장벽 밀착결합 단백질 Claudin-11의 조절

Abstract

MicroRNA (miRNA)는 20-22nt로 이루어진 작은 non-coding RNA며 epigenetic 수준의 유전자 기능조절 기전의 하나로 알려져 있다. MiRNA는 표적 mRNA의 3’-UTR에 결합하여 mRNA를 분해하거나 단백질 번역을 억제한다. Claudin-11 (Cldn11)은 Sertoli 세포에서 발현하는 밀착결합 단백질로 혈액정소장벽 (blood testis barrier)를 형성하며 정자형성을 위한 세정관 내부 환경 조성에 중요한 역할을 한다. In silco 분석을 통해 cldn11 mRNA를 표적으로 하는 miRNA를 예측한 결과 miR-25-3p를 포함한 다수의 miRNA가 확인되었다. 본 연구에서는 혈액정소장벽의 후성유전학적 조절기전 규명의 일환으로 miR-25-3p에 의한 Cldn11 발현의 변동을 조사하였다. 5, 15일령 수컷 생쥐 정소에서 in situ hybridization으로 miR-25-3p 발현을 확인한 결과 5일령 세정관에서 15일령 보다 현저히 높게 발현하였으며 5일령 정소에서 분리한 Sertoli cell에서도 miR-25-3p 발현량이 15일령 보다 유의적으로 높았다. 15일령 생쥐 정소에서 분리한 Sertoli cell에서 cldn11 mRNA와 단백질 발현은 miR-25 mimic에 의해 유의적으로 감소하였고, miR-25-3p inhibitor에 의해 증가되었다. 면역세포화학 분석을 통해 CLDN11 발현을 확인한 결과 miR-25 mimic에 의해 N-cadherin (+) adheren junction 부위에 CLDN11 발현이 감소하였다. MiR-25-3p가 tight junction 기능에 영향을 주는지 transepithelial electrical resistance (TER)을 측정한 결과, miR-25 mimic에 의해 유의하게 TER 값이 감소하였다. MiR-25-3p가 cldn11 mRNA 3’UTR 부위에 직접 결합하는지 확인하기 위해 생쥐 cldn11 mRNA 3’UTR 부위를 pGL3UC vector에 cloning 하여 293T cell에 형질전환하고 miR-25 mimic을 처리했을 때 luciferase 활성이 감소하였고 15일령 Sertoli cell에서도 동일한 결과를 얻었다. 결론적으로 Sertoli cell에서 miR-25-3p는 cldn11 mRNA 3’UTR에 직접 결합하여 RNAi를 발생시키고, cldn11 mRNA를 분해할 뿐 아니라 단백질 번역도 억제하고 이를 통해 혈액정소 장벽을 약화시키는 것으로 사료된다.