Effects of DHA-conjugation on the anticancer function of CP2c-targeting peptide

Abstract

CP2c는 적혈구 분화와 헤모글로빈 합성에 중요한 알파 글로빈 유전자의 발 현 조절에 중요한 역할을 하는 전사인자로서 면역반응, 신경 발생, 세포주기 조절 등 다양한 조절에 관여하며 모든 조직에서 발현하고 있다. 최근엔 CP2가 암세포에서 높은 발현을 보이며 oncogene으로도 알려졌다. 특히 간암에서 높 은 과발현을 보이고 있어 전사인자 CP2c를 억제하는 항암제 연구 보고가 되 고 있다. 선행 연구에서 CP2c와 결합하는 5종의 펩티드를 동정하였는데, 이 중 #5번 펩티드(ACP5)가 CP2c의 표적 DNA결합을 방해하는 것으로 밝혀졌 다. 여기서 유래한 6개의 펩티드에 세포 침투성 펩티드 iRGD를 연결시킨 ACP52C는 대부분의 암세포주에서 암세포 특이적인 세포사를 유도하였다. 게 다가 정상세포에는 전혀 영향을 미치지 않아 새로운 항암 펩티드 의약품의 후 보로 개발될 수 있음을 보여줬다. 그러나 펩티드이므로 전달 효능과 안정성 개선이 필요하다. 본 연구에서는 polyunsaturated fatty acid와 약물의 접합으 로 약물의 효능을 개선한다는 연구들에 착안하여 polyunsaturated fatty acid 인 docosahexaenoic acid (DHA)를 ACP52C에 결합한 후, 효용성을 in vitro와 in vivo에서 분석하고자 하였다. 우선 DHA만의 암세포 성장 억제능과 독성에 대해 암세포주와 정상세포주에서 MTT assay로 세포 생존도를 본 결과, 유의 미한 암세포 성장 억제능이나 독성은 나타나지 않았다. 또한 DHA와 ACP52C 를 emulsion으로 만들어서 ACP52C와 비교해보았으나, 기존의 ACP52C보다 암세포 세포사 능력이 감소함을 보였다. 한편 DHA를 ACP52C에 결합한 DHA-ACP52C를 제작하여 세포생장억제능을 확인한 결과, 기존의 ACP52C와 유사한 GI50값을 나타내며 암세포 특이적 세포사를 유도하였다. 따라서 DHA 와의 결합이 ACP52C 펩티드에 부정적인 영향을 미치지 않으면서 효능을 개선할 수 있는 가능성을 보여주었다. 한편, 세포주기 및 세포사관련 단백질의발 현변화를 Western blot으로 확인한 결과, DHA-ACP52C는 ACP52C와 유사한 경향을 나타내었다. 이는 DHA의 결합으로 인해 ACP52C의 특성이 그대로 유 지됨을 의미한다. 마지막으로, Hep3B xenograft mice를 확립한 후 3일과 5일 간격으로 정맥주입하여 DHA-ACP52C의 효용성을 확인해 본 결과, 기존의 간 암 치료제인 sorafenib 및 ACP52C 대비 우수한 항암 효과를 나타내었다. 특 히 이러한 효과는 5일 간격으로 주입한 경우에서 확연하였다. 따라서 DHA 결 합은 ACP52C의 체내 안정성을 증가시켰을 것이라 사료된다. 결론적으로 DHA를 CP2c 표적 펩티드 ACP52C에 결합시킬 경우, ACP52C의 항암능에 변 화를 주지 않지만 체내 안정성을 증가시켜 ACP52C의 효용성을 개선할 수 있 다.; ACP52, a six amino acid peptide had been found to efficiently inhibit CP2c complex formation to prevent DNA binding of CP2c complex. When this peptide was linked to a cell permeable peptide iRGD, the resulting ACP52C peptide induced cancer cell-specific cell death in most of cancer cells with no adverse effect on normal cells. However, ACP52C is unstable in solution and has a short half-life in vivo. In this study, we tested whether polyunsaturated fatty acid DHA-conjugation could stabilize ACP52C in vivo. First, MTT assay analysis showed that DHA-conjugated ACP52C induced cancer cell-specific cell death with similar extent of ACP52C. When analyzed expression changes of cell cycle- and cell death-related proteins by western blotting in DHA-ACP52C treated cancer cells, expression profiles were not different from those of ACP52C-related cells, suggesting DHA conjugation does not affect the anticancer effect of ACP52. Lastly, DHA-conjugated ACP52C had better efficacy than sorafenib or ACP52C in the Hep3B xenograft mice. Therefore, these results suggest that DHA-ACP52C has a better anti-cancer effect with improved efficacy in vivo than ACP52C alone