Microbial Biochemistry Associated with Sulfur Cycles in Fish Farm Sediments

Abstract

양식 활동에 의해 발생된 잉여 사료나 어류 배설물은 양식장 하부 퇴적물 내 빠르게 축적된다. 축적된 유기물은 대부분 황산염 환원 미생물에 의해 분해되어, 독성이 있는 황화수소(H2S)나 암모늄(NH4+)와 같은 물질을 생성하여 저서 생태계에 영향을 미치게 된다. 따라서 양식장과 같은 환경 내에 미생물에 의한 유기물 분해 과정 및 관여하는 미생물 군집에 대한 연구는 양식장 환경 평가를 위한 유용한 정보를 제공한다. 본 논문에서는 미생물 생지화학 분석과 분자학적 분석을 통해 양식장에 의한 연안생태계의 생지화학 과정의 변화를 관찰 하였고, 이를 효율적으로 평가하기 위한 적합한 화학적, 생물학적 환경 인자를 제안하고자 하였다. 또한 어류 양식장과 같이 다양한 유기탄소 화합물이 축적된 환경에서 혐기성 유기 탄소 산화와 직접적으로 관련된 미생물 군집을 밝히고자 하였다. 제 2장의 연구 결과 양식장 정점에서 증가하는 사료 량에 따라 퇴적물 내 황산염 환원에 의한 유기물 분해율과 그에 따른 대사 산물 (H2S, NH4+, PO43-)의 농도가 사료 공급이 전혀 없는 대조구 정점보다 상당히 높게 나타났다. 활발한 혐기성 유기물 분해 과정에서 발생된 저층의 용존무기질소와 용존무기인은 수층의 식물플랑크톤이 일차 생산에 필요한 영양염 요구량에 비해 각각 52-876%, 926-1048% 더 공급할 것으로 나타났다. 이 결과는 양식장 내 과도한 유기물 부하로 발생한 저층 영양염이 잠재적으로 연안 생태계에 유해한 부영양화나 적조를 유발할 수 있다는 것을 의미한다. 양식장 환경 평가를 위해 다양한 화학적 요소들과 공급된 사료량의 상관성을 비교한 결과, 황산염 환원율이 어류 양식장 내 유기 오염에 대한 유용한 정보를 제공할 수 있는 환경 인자로 나타났다. 하지만 어류 양식의 환경 영향을 평가하기에 효율적이며 통용적인 환경 인자를 고려한다면, 원소 황이 가장 적합한 환경 인자가 될 수 있음을 제안하였다. 제 3장에서는 양식장 내 환경 영향 평가를 위한 생물학적 인자를 조사하기 위해, dsrA 유전자와 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하였다. 그 결과 양식장 퇴적물 내의 주요한 황산염 환원 미생물은 Syntrophobacteraceae와 Desulfobulbaceae 그룹으로 나타났다. 흥미롭게도 양식장 정점에서 황산염 환원율 (12.2-19.6 mmol m-2 d-1)이 높음에도 불구하고 황화수소 농도 (< 8 µM)는 매우 낮게 나타난 구간에서 Gammaproteobacteria와 Epsilonproteobacteria와 같은 황 산화 미생물이 높게 나타났다. 특히 양식장 정점의 1-2 cm 깊이에서는 Epsilonproteobacteria에 속하는 Sulfurovum이 전체 16S rRNA 유전자 염기서열 중 62%로 가장 높은 상대적 분포를 보였다. 이 연구 결과를 바탕으로 제 4장에서는 양식 활동 주기에 따른 미생물 군집의 시공간적 변화를 살펴보았다. 그 결과 황산염 환원과 그에 따라 발생한 대사산물의 농도가 높았던 양식 활동 중기와 후기 단계에서 양식장 정점에 Sulfurovum이 높게 나타났다. 따라서 Sulfurovum와 같은 미생물이 양식 활동에 따른 퇴적물 상태의 시간적 변화를 나타내는 중요한 정보를 제공함으로 양식장 환경을 평가하기에 잠재적인 생물학적 환경 인자로 제안될 수 있다는 것을 시사하였다. 제 5장에서는 양식장 퇴적물 내 혐기성 유기물 분해과정에서 주요 말단 전자 공여체인 acetate와 glucose의 산화를 담당하는 활성 미생물 군집을 확인하기 위해 대사 활성 측정과 RNA-안정 동위원소 표지법의 통합 연구를 수행하였다. 퇴적물 슬러리에 13C-glucose와 12C-glucose, 13C-acetate와 12C-acetate를 각각 첨가하여 7일간 배양한 결과, glucose가 첨가된 퇴적물 슬러리에서는 혐기성 대사가 촉진되었지만, acetate가 첨가된 슬러리에서는 아무런 변화가 보이지 않았다. 7일차의 13C-glucose가 첨가된 슬러리에 RNA을 분석한 결과, 첫 번째로 나타난 주요 박테리아 군집은 Gammaproteobacteria에 속하는 Psychromonas와 Vibrio로 나타났다. 이 군집에서 나타난 주요 종은 대부분 발효하는 혐기성 미생물로 glucose 분해하면서 CO2을 발생하고 acetate와 같은 2차 유기물을 생성하였다. 두 번째 주요 박테리아 군집은 Desulfobacteraceae에 속한 미생물로 대부분 acetate와 같은 유기물을 CO2형태로 완전히 산화하는 황산염 환원 박테리아와 관련이 있었다. 따라서 어류 양식장 퇴적물에 glucose와 같은 유기물이 축적되면 Psychromonas나 Vibrio와 같은 발효 미생물과 Desulfobacteraceae와 같은 황산염 환원 박테리아가 각각 혐기성 먹이 사슬의 초기 및 최종 단계에서 유기 탄소 산화에 중요한 역할을 할 것이라는 것을 제시하였다.; Organic matter such as uneaten fish feed and fecal materials caused by aquaculture activities accumulates rapidly in sediments below fish farm. And the accumulated organic matter accelerates anaerobic organic carbon oxidation such as sulfate reduction (SR), which induces the accumulation of toxic hydrogen sulfide (H2S) and ammonium (NH4+) in sediments. In organically-enriched sediments such as fish farm, studies on the decomposition processes of organic matter by microorganisms and their community structure and composition provide useful information to evaluate the aquaculture environments. In this dissertation, a combined study of biogeochemical and molecular microbiological analyses was conducted to elucidate impact of finfish aquaculture on biogeochemical processes, to suggest relevant proxies for assessing farming condition, and to identify microbial communities involved decomposition of organic matter. In Chapter 2, change in the biogeochemical process with increasing fish feed input were observed. As a result, rate of SR and resultant metabolic products (H2S, NH4+, and PO43-) concentrations were significantly greater at the farm site than control site. Benthic release of dissolved inorganic nitrogen (DIN) and phosphorus (DIP) from farm sediment accounted for 52–837% and 926–1048%, respectively, of the potential demand of DIN and DIP for phytoplankton production. The results suggest that excess organic loading in fish farms may induce deleterious eutrophication and algal blooms in coastal ecosystems via benthic-pelagic coupling. Among all parameters measured in the present study, direct SR measurement provided the most useful tool as an indicative of organic contamination in fish farm. However, elemental sulfur was regarded as the most appropriate proxy, considering efficiency and interoperability to assessing the environmental impact of finfish aquaculture. In Chapter 3, a combination of biogeochemical analyses and molecular microbiological analyses was conducted to assess the environmental impact of finfish aquaculture and to elucidate the major microbial assemblages responsible for the production and removal of reduced sulfur compounds in fish farm sediments. Average concentrations of H2S (123 µM) and NH4+ (1336 µM) and the dsr (dissimilatory sulfite reductase) gene copy number (3.4 × 109 copies cm-3) in the sediments at the farm site were 30, 11 and 2 times higher, respectively, then those measured at the less impacted reference site. Accordingly, the sulfate reduction rate (SRR) at the farm site (118 mmol m-2 d-1) was 19 times higher than that measured at the reference site (6.2 mmol m-2 d-1). Analyses of dsrA and 16S rRNA gene sequences revealed that the Syntrophobacteraceae and Desulfobulbaceae groups were the major sulfate-reducing bacteria around the fish farm sediment. Interestingly, despite the high SRR (12.2–19.6 mmol m-2 d-1), the H2S concentration was low (< 8 µM) in the top 0-2 cm of the fish farm sediments. In this sulfide mismatched zone, sulfur-oxidizing bacteria associated with Gamma- and Epsilonproteobacteria was abundant. In particular, at the 1-2 cm depth, bacteria related to Sulfurovum in the Epsilonproteobacteria showed the highest relative abundance, comprising 62% of the 16S rDNA sequences. The results strongly suggest that Sulfurovum-like bacteria plays significant ecological and biogeochemical roles in oxidation and reduction of reduced sulfur compounds from the organic-rich, highly sulfidic fish farm sediments. In Chapter 4, temporal variations of benthic microbial composition and community structures, in combination with sediment geochemistry and microbial SR, were investigated to accurately assess the environmental impact of fish farming at three stages of aquaculture activities: (1) early— (after stocking of juvenile fish), (2) mid— (during intensive fish culturing), and (3) post— (immediately after harvesting). SRR and concentrations of its metabolites in sediments were significantly higher at mid and post stages than at early stage. Accordingly, bacterial communities at mid and post stages were distinct from those of early stage and the control. Gammaproteobacteria and Deltaproteobacteria dominated microbial communities at all stages, whereas Sulfurovum in Epsilonproteobacteria appeared significance only at highly sulfidic conditions (i.e., mid and post stages). It demonstrated that microbial communities, especially the appearance of Sulfurovum, provide essential information on the temporal variations in sediment conditions, reflecting the intensity of aquaculture activities during the farming cycle. In Chapter 5, a combined study of metabolic rate measurements and RNA–stable-isotope probing (RNA-SIP) was conducted to identify the active microbial communities in finfish farm sediments responsible for the oxidation of acetate and glucose. Glucose (13C and 12C) and acetate (13C and 12C) were added to sediment slurries over seven days. Anaerobic metabolism was stimulated in sediment slurries by the addition of glucose, whereas no increase was observed in the sediment slurries with an addition of acetate. Based on these results, the dominant bacterial group detected in the heavy RNA-SIP fraction of a 13C-glucose slurry in day 7 was related to Psychromonas and Vibrio belongs to Gammaproteobacteria. Their major members are known to grow anaerobically by fermenting glucose, which results in the production of carbon dioxide (CO2) gas and various organic acids such as acetate. The second major bacterial members were related to acetate-degrading sulfate reducers affiliated with Desulfobacteraceae, which were also found in fish farm sediment. The findings indicate that Psychromonas, Vibrio, and SRB affiliated with Desulfobacteraceae play significant roles at the initial and final stages, respectively, in the organic carbon oxidation of an anaerobic food chain in fish farm sediments.