Regulation of Oxidative Stress and Neuroinflammation by LRRK2 and Discovery of Biomarker in Parkinson’s Disease

Abstract

파킨슨씨병은 치료가 불가능한 신경퇴행성 질환이다. 파킨슨씨병은 뇌의 흑질에 있는 도파민성 신경세포의 선택적인 사멸이 나타나며, 운동성과 비운동성 증상들이 나타난다. LRRK2는 파킨슨씨병 유발유전자로, 앞선 연구들에서 LRRK2의 인산화 기능증가로 인한 미토콘드리아 손상과 세포자멸사, 핵소체 붕괴가 야기되며, LRRK2 인산화효소 저해제를 통해 이것들로부터 벗어난다고 발표됬다. 이 연구에서는 분화시킨 SH-SY5Y 세포에 Rotenone 처리를 통해 산화적 스트레스를 주었을 때 LRRK2의 인산화 기능의 증가를 확인했으며, 또한 HSP70과 Nucleolin의 증가를 확인했다. Cycloheximide를 Rotenone과 함께 세포에 처리한 경우, HSP70과 Nucleolin 의 증가가 억제되며 세포독성이 증가되었음을 확인했다. 분화시킨 SH-SY5Y 세포와 쥐 대뇌피질 일차배양 세포에 LRRK2 G2019S 돌연변이 유전자를 유전형질주입해 HSP70과 Nucleolin 의 증가를 확인하고, LRRK2 인산화효소 저해제을 함께 처리해 HSP70 과 Nucleolin 증가의 억제와 세포독성 감소를 확인했다. 또한 LRRK2 G2019S 돌연변이 유전자가 이식된 쥐의 뇌에서도 HSP70과 Nucleolin 이 증가하였다. 이 결과들을 통해 LRRK2의 인산화 기능의 억제가 산화적 스트레스에 의해 촉진되는 세포사멸과 파킨슨씨병의 진행을 방지하는 데에 영향을 미친다는 것을 확인했다. 다음으로, 파킨슨씨병의 병리학에서 중요한 역할을 하는 산화적 스트레스에 대한 잠재적인 생물학적 진단지표의 발견과 이를 측정하기 위한 방법을 연구했다. 산화적 스트레스는 도파민성 신경세포의 세포독성을 악화시키는 중요 요인으로 파킨슨씨병의 진행을 촉진한다. DJ-1은 파킨슨씨병의 유발유전자로 산화적 스트레스의 감지와 제거 역할을 맡고 있다. DJ-1은 산화적 스트레스에 의해서 산화된 DJ-1으로 변형되며 파킨슨씨병의 생물학적 진단지표로서 사용될 가능성이 있음이 시사되었었다. 이 연구에서는 산화된 DJ-1이 파킨슨씨병 환자들에게서 증가되었을 것이라고 추측했고, 산화된 DJ-1의 세심한 측정을 위해, 과산화수소로 산화시킨 HEK293T 세포와 재조합 DJ-1 유전자를 사용해 효소면역측정법 (ELISA)을 확립했다. 이를 사용해 파킨슨씨병 환자의 소변에서 정상의 두 배에 달하는 산화된 DJ-1이 검출됨을 확인해, 산화된 DJ-1이 파킨슨씨병을 진단할 수 있는 생물진단지표로의 사용 가능성을 확인할 수 있었다. 마지막으로, 신경세포염증반응에 대한 LRRK2와 α-synuclein의 상호작용에 대해 연구하였다. 신경세포염증은 파킨슨씨병에서 나타나는 특징 중 하나이며, 파킨슨씨병을 유발하는 유전자들과 관련되어있다. α-synuclein은 Toll 유사수용체에 결속해 미세아교세포를 활성화시켜 신경세포염증을 일으킨다. α-synuclein과 LRRK2는 서로 상호작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 우리는 신경세포염증에 대해서도 상호작용할 것이라 생각했다. 우리는 α-synuclein이 구성된 media (αS-CM)와 α-synuclein 올리고머를 만든 후 구성을 확인해 실험에 사용했다. αS-CM 과 α-synuclein 올리고머는 BV-2 세포에 각각 투여되었고 신경세포염증의 증가를 확인했다. 그리고 LRRK2 인산화효소 저해제에 의해 이러한 신경세포염증이 감소하는 것을 확인하였다. 마지막으로, 분리한 αS-CM 와 α-synuclein 올리고머의 Toll 유사수용체2 활성화 여부를 HEK-blue Toll 유사수용체2 활성화 실험으로 확인했다. 이를 통해 LRRK2 인산화 억제약물이 α-synuclein에 의한 파킨슨씨병의 신경세포염증에 대해 긍정적으로 작용할 가능성을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 통해, 파킨슨씨병 유발유전자와 산화적 스트레스, 신경세포염증의 연관성들에 대해 연구하는 것이 파킨슨씨병의 치료법을 찾는 데 효율적인 방법이라고 제안한다.; Parkinson’s disease (PD) is an incurable neurodegenerative disease. PD patients show selective degeneration of dopaminergic neurons in substantia nigra (SN) and display various motor and mental symptoms. Leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2) is a PD-causative gene and G2019S mutation increases its kinase activity. Oxidative stress is a risk factor of PD which aggravates death of dopaminergic neurons and accelerates the PD progression. Previous studies demonstrated that upregulated LRRK2 kinase activity induced apoptosis, mitochondrial dysfunction, and nuclear disruption, and these effects were rescued by LRRK2 kinase inhibitor. From these studies, we hypothesized that oxidative stress induced LRRK2 kinase activity connected with protective mechanism. Rotenone-mediated oxidative stress increased LRRK2 kinase activity along with increases in heat shock protein 70 (HSP70) and nucleolin (NCL) of differentiated SH-SY5Y (dSY5Y) cells. Cycloheximide (CHX) repressed HSP70, and NCL expression which was increased by rotenone, and increased cytotoxicity. Ectopic expression of LRRK2 G2019S in dSY5Y cells and rat primary cortical neurons displayed increased HSP70 and NCL, whereas treatment of LRRK2 kinase inhibitor decreased cytotoxicity and attenuated the HSP70 increase. LRRK2 G2019S mutation transgenic mice (GS TG mice) brains showed increased LRRK2 kinase activity and expression of HSP70 and NCL. Altogether, the inhibition of LRRK2 kinase activity might prevent oxidative stress-mediated neurodegeneration and PD progression. Next, we identified oxidized DJ-1 (OxiDJ-1) as a potential PD biomarker and developed sensitive detection methods of the OxiDJ-1. The DJ-1 has an important function as a sensor and eliminator of oxidative stress and its mutation is a cause of PD. Previous studies demonstrated that oxidative stress induced OxiDJ-1 formation. From these, we hypothesized that OxiDJ-1 could be increased in PD patients than controls. The developed OxiDJ-1 ELISA and it could detect 2 fold increase in OxiDJ-1 level from PD patients’ urine than controls. However, Western blot showed no difference in OxiDJ-1 levels between urine of PD patients and controls. Collectively, I suggested that OxiDJ-1 could be a potential diagnostic biomarker of PD. Next, we investigated the relationship of α-synuclein (-syn) oligomer with LRRK2 kinase activity in neuroinflammation. Neuroinflammation is one of the hallmarks of PD pathogenesis. α-Syn, PD-causative gene, activates toll-like receptor 2 (TLR2) and induce neuroinflammation along with microglia activation. α-Syn and LRRK2 interplay each other and predispose dopaminergic neurons to be weaker to cellular stresses. From these researches, we hypothesized α-syn and LRRK2 might interplay in neuroinflammation. We generated α-syn conditioned media (S-CM) from media of dSY5Y which were transfected with Flag-tagged -syn plasmid DNA. We also used recombinant oligomeric α-syn separated from total recombinant α-syn by size exclusion chromatography. We found αS-CM and oligomeric α-syn increased neuroinflammation in BV-2 microglia and those enhancements were decreased by LRRK2 kinase inhibitor. Then, we confirmed both αS-CM and α-syn oligomers activate TLR2 by HEK-blue TLR2 activity test. Conclusively, this study demonstrates that LRRK2 kinase inhibitor alleviated TLR2-induced neuroinflammation which was activated by α-syn oligomer. I suggest that studying relationship between PD-related genes with mechanisms underlying PD, such as oxidative stress and neuroinflammation, could be an efficient way to discover therapeutic method for PD.