Cell-free therapeutic systems using exosomes derived from human adipose stem cells for the treatment of osteoarthritis

Abstract

본 연구는 증식하는 줄기세포로부터 분비되는 엑소좀과 연골세포로 분화하는 줄기세포로부터 분비되는 엑소좀을 이용하여 퇴행성 관절염의 치료제로 적용할 수 있는 무세포 치료 시스템을 개발하는 것을 목표로 한다. ‘줄기세포’는 다양한 세포로 분화할 수 있는 다중분화능을 가진 세포로서 난치성 또는 퇴행성 질환 치료제로서 주목받고 있으며, 현재 줄기세포를 이용한 수많은 임상시험들이 진행되고 있다. 하지만, 줄기세포를 이용한 다양한 질환의 치료에 있어서 해결되지 않은 여러 한계점과 부작용들이 보고되고 있다. 특히, 동종 유래 줄기세포의 경우, 체외 배양 시 줄기세포의 특성을 유지하면서 원하는 양의 세포 수를 얻기 위한 기술적 한계가 있으며 투여 시 면역거부반응이 발생할 위험이 있다. 또한, 체내 주입된 줄기세포의 생존율이 매우 낮고, 원하지 않는 세포로 분화를 할 가능성도 있으며 생물학적 변성으로 인해 암을 발생시키는 부작용들이 있다. 최근 연구들에 의하면, 줄기세포를 손상된 조직 부위에 투여하였을 때, 투여된 줄기세포가 주변 조직 환경에 자극을 받아 분비하는 특정 분비물에 의해 치료 효능이 나타난다고 보고되고 있다. 특히, 줄기세포의 분비물 중 ‘엑소좀’은 30-200 nm의 크기를 갖는 나노소포체로서 세포 사이에 다양한 단백질(사이토카인, 성장 호르몬 등)과 유전물질(mRNA, microRNA등)을 전달하면서 세포간 신호전달의 중요한 매개체 역할을 하고 있다. 현재 줄기세포 유래 엑소좀은 기존의 줄기세포 치료제의 한계점을 극복하면서 줄기세포와 거의 동등한 치료효과를 갖는 차세대 조직재생 치료제로서 활발히 연구되고 있다. 따라서 본 연구에서는 지방유래 줄기세포로부터 추출한 엑소좀을 퇴행성 관절염 치료제로서 적용하여 엑소좀의 연골 조직 재생 효과에 대해 확인하였다. 첫 번째 연구에서는 퇴행성 관절염 동물 모델을 이용하여 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 치료 가능성을 확인하였다. 엑소좀은 다중필터시스템 (TFF)을 이용하여 추출하였으며, 추출된 엑소좀은 지방조직 유래 줄기세포 및 환자 유래 연골세포 내로 효율적으로 흡수됨을 확인하였다. 또한, 추출된 엑소좀은 환자 유래 연골세포의 증식 및 이동을 향상시키고, 친 염증성 사이토 카인(IL-1β)에 의해 유도되는 연골 분해 활성 물질들(MMP-1, MMP-3, MMP-13, ADAMTS-5)을 억제하는 것을 확인하였다. 퇴행성 관절염 동물 모델을 이용한 실험을 통해서도 엑소좀이 손상된 연골 조직을 재생시키고, 관절염으로 인한 염증 반응을 억제하여 퇴행성 관절염의 진행을 효과적으로 막는 것을 확인하였다. 두 번째 연구에서는 연골세포로 분화하는 줄기세포 유래 엑소좀을 이용하여 퇴행성 관절염 치료제로서 적용하였다. 추출된 엑소좀 내에는 항 염증성 사이토카인(IL-4, IL-10, IL-13)과 연골 세포의 항상성 및 연골 기질 합성에 도움을 주는 인자들이 다양하게 존재함을 확인하였고, 세포 독성 없이 엑소좀이 세포 내로 효율적으로 흡수됨을 확인하였다. 또한, in vitro에서 지방조직 유래 줄기세포의 지방세포로의 분화를 효과적으로 유도하였다. 퇴행성 관절염 동물 모델에 엑소좀을 적용하였을 때 연골이 파괴되는 것을 막을 뿐만 아니라 연골 기질이 재생되는 것을 확인하였다. 이러한 연구 결과들을 통하여 엑소좀이 항 염증성 인자 및 연골 형성 인자들을 손상 부위의 세포에 전달함으로써 연골 조직의 항상성을 회복시키고 최종적으로 효과적인 퇴행성 관절염 치료제로서 적용될 수 있음을 확인하였다.; Mesenchymal stem cells (MSCs) are multipotent stromal cells, which possess self-renewal capacity and multilineage differentiation, and their therapeutic potential has been explored in a number of clinical trials. However, there are unwanted side effects of the use of MSCs, including low survival rate in vivo, adoption of unwanted phenotypes, and technical limitation of pluripotency maintenance during in vitro expansion. Moreover, recent evidence indicated that MSCs exert their therapeutic effects through paracrine mediators, particularly exosomes. Exosomes play a critical role in intracellular communications by transferring endogenous or exogenous cargo to recipient cells, and thus affect normal physiology as well as in states of disease. In this study, we investigated that the therapeutic effects of exosomes derived from human adipose derived stem cells (hASCs) for the treatment of osteoarthritis (OA). In chapter 2, we investigated the therapeutic potential of proliferating stem cells-derived exosomes (P-EXOs) in alleviating OA, along with the mechanism. We observed that P-EXOs-mediated attenuation of cartilage degradation was characterized by enhanced cell proliferation and migration, and immunomodulatory activity. Exosomes were isolated from the conditioned media of hASCs by a multi-filtration system based on the tangential flow filtration (TFF) system. The sizes and morphologies of the exosomes were evaluated by dynamic light scattering and transmission electron microscopy, and the exosomal markers were confirmed by flow cytometry analysis. In vitro test, P-EXOs not only promoted the proliferation and migration of human OA chondrocytes, but also maintained the chondrocyte matrix by increasing type Ⅱ collagen synthesis and decreasing MMP-1, MMP-3, MMP-13, and ADAMTS-5 expression in the presence of IL-1β. To evaluate therapeutic efficacy of P-EXOs in vivo, the P-EXOs were administered intra-articulary into the knee joints of monosodium iodoacetate (MIA)-injected rats and the surgical destabilization of the medial meniscus (DMM) model of OA in mice. We found that the intra-articular injection of P-EXOs significantly attenuated OA progression and suppressed synovial inflammation, and also inhibited the infiltration of M1 macrophages into the synovium. These overall results demonstrated that the P-EXOs effectively protect cartilage from degeneration and attenuate OA progression by modulating immune reactivity. In chapter 3, the potential effects of exosomes secreted during the chondrogenic differentiation of hASCs were investigated in vitro and in vivo. The differentiating stem cell-derived exosomes (D-EXOs) characterized in terms of size and morphology by TEM and DLS, exosomal markers by flow cytometry analysis, and internal contents by cytokine array analysis. It was identified that several cytokines associated with cartilage repair, such as interleukin 4 (IL-4), IL-10, IL-13, fibroblast growth factor 9 (FGF-9), insulin growth factor 1 (IGF-1), transforming growth factor-beta 1 (TGF-β1) and TGF-β2, were expressed in D-EXOs. In vitro experiment showed that D-EXOs induced chondrogenic differentiation of hASCs. We also evaluated the therapeutic effects of D-EXOs in vivo using MIA-induced OA rat model. Morphological changes and severity of cartilage degradation were evaluated using H&E and safranin O-fast green staining. Histological analysis showed that the intra-articular injection of D-EXOs with HA effectively attenuated the cartilage degradation compared with PBS or HA treatment groups. These observations demonstrated that the D-EXO treatment attenuate the cartilage destruction as well as regenerate cartilage matrix, and suggested that therapeutic efficacy of D-EXOs was attributed to chondrogenic factors within exosomes.