FRET 기법으로 발굴된 PLK1 억제제 Genistein의 암세포 사멸 효과

Title
FRET 기법으로 발굴된 PLK1 억제제 Genistein의 암세포 사멸 효과
Other Titles
Effects of Genistein, a PLK1 Inhibitor Identified via FRET Assay, on Cancer Cell Death
Author
우상욱
Alternative Author(s)
Woo, Sang Uk
Advisor(s)
임형신
Issue Date
2019-02
Publisher
한양대학교
Degree
Doctor
Abstract
최근 표적 항암 치료로 세린/트레오닌 인산화효소 억제제에 대한 관심이 늘어나고 있다. 대표적인 세린/트레오닌 인산화효소로서 세포주기 중, 유사분열을 조절하는 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있는 PLK1 (Polo-like kinase 1)은 다양한 암세포 중, 유방암, 전립선암, 대장암, 비소세포 폐암 등에서 과발현되어 있으며, PLK1의 과발현으로 인해 암세포 성장촉진, 암세포 사멸억제, 암세포 전이, 항암제 내성이 발생하여 PLK1을 억제할 수 있는 화합물 개발이 필요한 실정이다. PLK1을 억제할 수 있는 화합물을 개발하기 위해, PLK1 인산화 활성의 측정이 필요하다. 인산화 활성을 측정하는 대표적인 방법은 방사성 동위원소와 immunoblot 기반의 실험법이 있는데, 방사성 동위원소 실험법의 안전성 저하 및 긴 실험 시간이라는 단점과 immunoblot 기반 실험법의 항체 구입에 대한 고비용 및 긴 실험 시간이라는 단점으로 인해 이를 극복할 수 있는 새로운 실험방법의 개발이 절실하다. 본 연구에서는 두 종류의 형광물질이 가까운 거리에 있을 때 발생되는 공명에 의해 에너지를 전달하는 원리를 가진 형광 공명 에너지 전이 실험법 (Fluorescence resonance energy transfer, FRET)을 이용하였다. FRET 기반의 실험법 확립 과정에서, PLK1 원형/활성형/불활성형 단백질들이 정제되었고, 온도 등의 실험 조건도 결정되었다. 또한, PLK1 억제제의 개발에 적합한 인산화 활성 측정법을 선택하기 위해, FRET 기반의 실험법, 방사성 동위원소 기반의 실험법, immunoblot 기반의 실험법이 비교되었다. 3가지 실험법에서 인산화 측정값은 유사하게 나타났지만, FRET 기반의 실험법이 방사성 동위원소와 immunoblot 기반의 실험법에 비해 안전성, 실험 시간, 규모 면에서 우수함을 확인하였다. 이를 바탕으로, 확립된 FRET 기반의 PLK1 인산화 활성 측정법을 이용하여 천연물로부터 분리된 화합물 라이브러리에서 PLK1 인산화 활성을 억제하는 PLK1 억제제를 발굴하고자 하였다. 이를 기반으로 genistein, baicalein, 7-O-methylwogonin, dihydrobaicalein, viscidulin Ⅱ가 PLK1의 활성을 억제하는 것을 관찰하고, 이 억제제들이 약 26종의 인산화효소를 이용한 인산화효소 프로파일링 실험에서 다른 인산화효소들보다 PLK1에 대한 높은 선택성을 가지는 것을 확인하였다. 또한, 발굴된 5가지의 화합물이 PLK1의 억제제로 역할이 가능한지를 평가하기 위해 세포 사멸 효과를 확인하고자 하였다. 세포 사멸 효과 실험에 사용될 세포를 선정하기 위해 정상, 유방암, 간암, 전립선암, 대장암, 폐암 세포주에서 PLK1 발현을 확인하였고, 그 결과 정상 세포주인 hTERT-RPE에 비해 PLK1 발현이 증가되어 있는 MCF7, BT20, LNCaP, HCT116, HCT15 세포를 선정하였다. 선정된 세포주를 이용하여 세포 사멸 효과를 실험한 결과, genistein, baicalein, dihydrobaicalein, viscidulin Ⅱ는 암세포를 선택적으로 사멸하는 것으로 나타났다. 그 중, genistein은 유방암, 자궁경부암 세포와 항암제 내성을 가진 전립선암 세포에서 유사분열 정지를 유도하여 PLK1의 활성을 억제하는 것으로 확인되었다. 결론적으로, 본 연구에서는 형광 공명 에너지 전이 실험법은 안전하고 실험시간도 짧아 많은 수의 PLK1 억제제의 screening에 적합한 실험 방법이며, 이 방법을 통해 천연물 라이브러리에서 발굴된 genistein, baicalein, 7-O-methylwogonin, dihydrobaicalein, viscidulin Ⅱ는 PLK1의 인산화 활성을 감소시키며, PLK1에 대한 높은 선택성을 가지는 것을 확인하였다. 또한, genistein, baicalein, dihydrobaicalein, viscidulin Ⅱ는 암세포 선택적으로 사멸 효과가 있고 4가지 약물 중, genistein은 PLK1의 활성을 억제함으로 유사분열을 억제한다는 것을 규명하였다. 따라서 본 연구를 통해 항암제로서 신약으로 개발될 수 있는 새로운 PLK1 억제제를 발굴하는 좋은 방법인 FRET assay를 확립하였고, 발굴된 PLK1 억제제가 신규 표적 항암제로서의 가능성을 제시하였다.
URI
http://dcollection.hanyang.ac.kr/common/orgView/000000108983http://repository.hanyang.ac.kr/handle/20.500.11754/99415
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