Development of high-speed multimodal microscopy utilizing two-photon fluorescence lifetime imaging and second harmonic generation

Abstract

광학 현미경은 시편에 직접 영향을 주지 않고 생체조직과 같은 미세구조를 고해상도로 관찰이 가능한 장점 때문에 생명과학 및 의학 분야에서 그 위상이 점점 높아지고 있다. 현대에 이르러서는 단순 구조 정보만이 아니라 분자 결합 정보, 물질 분포, 이온 농도 등 화학적 정보 또한 얻을 수 있게 되었다. 하지만 구조적 혹은 화학적 정보 하나만으로는 생체조직의 종합적 분석이 어렵다. 이에 따라 여러 현미경을 하나로 합쳐 여러 구조 정보와 화학 정보를 한번에 얻어 분석할 수 있는 다기능 현미경이 널리 사용되고 있다. 형광 수명 현미경(Fluorescence lifetime imaging microscopy)은 생체 내 여러 생화학적 분자의 분포를 시각화 할 수 있어 다기능 현미경에 자주 사용된다. 하지만 기존 다기능 현미경은 형광 수명 영상을 실시간으로 얻지 못하였고, 아날로그 평균 지연법 (Analog mean-delay)을 이용하여 실시간 영상화가 가능한 경우에는 조직 표면에서의 영상만 얻을 수 있었다. 2광자 현미경 (Two-photon excitation microscopy)은 조직 깊은 곳까지 영상화가 가능하여 형광 수명 현미경과 결합하면 깊은 곳의 형광 수명 영상을 얻을 수 있다. 또한 2차 고조파 영상화 현미경 (Second harmonic imaging microscopy)도 깊은 곳까지 영상화가 가능하며 생체 조직 내 콜라겐, 미오신 등 특정 분자를 보는 것에 사용된다. 본 연구에서는 이광자 현미경, 2차 고조파 이미징 현미경, 아날로그 평균 지연 형광 수명 현미경을 통합하여 고속으로 조직 깊은 곳까지 동시에 영상화가 가능한 복합현미경을 개발하고자 한다. 빠른 속도로 영상을 얻기 위해 형광 수명 현미경은 아날로그 평균 지연법을 적용하였고, 광원으로는 펨토초 펄스 레이저를 이용하였다. 디지타이저의 성능 한계 때문에 발생하는 측정 오차를 측정하여 전후 보정을 시행하였으며 영상 저장까지 걸리는 시간을 측정하였다. 쥐의 폐를 이용하여 실시간 동영상을 얻었고, 건강한 쥐의 폐와 신장으로 이광자, 2차 고조파, 형광 수명 영상을 획득하여 삼차원 영상으로 재구성했다. 그리고 토끼 동맥으로 이광자, 2차 고조파, 형광 수명 영상을 동시에 획득했다. 폐의 경우, 폐 표면에서 강한 2차 고조파 신호가 검출되었고 이광자 영상은 표면과 그 안쪽까지도 확인할 수 있었다. 또한 형광 수명 영상을 통해 두 종류의 폐세포로 추정되는 두 구역을 확인하였다. 신장에서는 세뇨관으로 추정되는 구조를 확인하였으며 세뇨관 별로 형광의 차이가 나타났으며, 세뇨관 구조와 내강벽에서 형광 수명이 다르게 나타남을 확인하였으며, 내강벽에서 나온 형광은 내벽의 미세융모 (microvilli)에서 유래한 것으로 추정된다. 토끼 동맥에서는 2차 고조파 영상을 기기 응답 함수 (Instrumental response function)로 이용하여 세 가지 영상을 동시에 실시간으로 획득하였다. 동맥 바깥막에서 2차 고조파 신호가 뚜렷하게 관찰되었으며, 강한 2광자 형광 신호를 중간막에서 확인할 수 있었고, 엘라스틴으로 추정되는 형광 수명 영상을 확인했다. 본 연구에서는 2광자 현미경, 2차 고조파 영상화 현미경, 형광 수명 현미경을 통합한 다기능 현미경을 개발하였고, 쥐의 폐와 신장, 토끼 동맥의 구조화학적 정보를 확인할 수 있었다. 본 연구에서 개발한 다기능 현미경은 의생명분야 연구에 도움이 될 것으로 보인다.; Optical microscopy has been considered as a powerful tool in biological and medical field due to its imaging performance in terms of resolution. Optical microscopy can detect chemical information such as molecular binding, distribution, ion concentration as well as structural information recently. However, with one information of structure or molecule, it is hard to understand the state of a biological tissue. Therefore, multimodal optical microscopy incorporating various microscopes has become a hot topic in the field of optical microscopy. A fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) have been used popular in multimodal microscopy because it can visualize the distribution of molecules in various biological tissues. The imaging speed of FLIM was usually too slow for real-time imaging. Using analog mean-delay (AMD), high-speed FLIM technique, some studies achieved faster FLIM imaging, but the FLIM information was restricted to tissue surface. These issues can be solved by combining AMD-FLIM with a two-photon excitation microscopy (TPEM) which can acquire fluorescence signals from deep tissues. Furthermore, a second harmonic imaging microscopy (SHIM) is also capable of deep tissue imaging. It can target specific biological molecules such as collagen, myosin, etc. By integrating those three different modalities introduced above, deep tissue structural and biochemical imaging can be achieved. In this study, a high-speed multimodal microscopy utilizing two-photon excitation microscopy (TPEM), second harmonic imaging microscopy (SHIM), and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) was proposed. A femtosecond pulsed laser was used for light source and analog mean-delay (AMD) was adopted for fast FLIM. Imaging error occurred due to the discrepancy between the laser sync and digitizer sampling. These errors could be measured and reduced by imaging acquisition software including sampling point skipping algorithm. Then, the remaining errors were corrected numerically using standard sample target. After the compensation, post-processing was applied to enhance image quality. The whole image acquisition time was recorded including the error correction processes. The FLIM performance was tested with Coumarin 6, and rhodamine B. At last, the developed system was validated with mouse lung, kidney, and rabbit artery. With mouse lung, SHIM and TPEM images were acquired and reconstructed in 3D. Strong second harmonic signal was detected from the surface, and TPEM image showed inner tissue structures. And two regions with different lifetime were detected probably denoting pneumocytes type I and II. With mouse kidney, TPEM images showed some tubular structures which regarded as proximal and distal tubules. Distinct lifetime differences between tubular structures and inner wall were observed. Probably, the lifetime signal of inner wall originated from actin filaments of brush border. With rabbit artery, SHIM was used as instrumental response function (IRF). As the result, SHIM, TPEM and FLIM images could be acquired simultaneously. Abundant second harmonic signal was observed in tunica adventitia. And strong two-photon fluorescence was found from tunica media, and a FLIM image was acquired which regarded as elastin fluorescence. In this study, a high-speed multimodal microscopy was developed which integrated TPEM, SHIM and FLIM. It was demonstrated with mouse lung, kidney, and rabbit artery and their structural, and chemical information were observed. We expected that developed system gives contributes to various biomedical studies.