High-sensitive and Colorimetric Detection of Glucose with Glucose Oxidase-mimicking Gold Nanoparticles and Cerium Oxide Nanoparticles

Abstract

당뇨병은 현재 전 세계에서 약 4억 2500만 명의 인구가 앓고 있는 대중적인 질환이다. 당뇨병 환자, 혹은 당뇨가 의심되는 사람들의 경우 주기적인 혈당 측정이 필요하다. 기존에 사용하는 혈당 측정기는 혈당을 포도당 산화효소를 이용해 전기화학적으로 측정하는 방식이다. 이 포도당 산화효소는 단백질로 이루어져 있기 때문에 온도와 pH 변화에 민감하고, 가격이 비싸다는 단점이 있다. 나노 입자는 보관이 용이하고 대량생산이 가능하다는 장점이 있기에 이를 보완하고자 산화효소 역할을 대체할 수 있는 나노 입자를 이용하기로 했다. 또한, 혈당을 측정하는 센서는 침습적이기 때문에 고통을 유발하고 감염의 우려가 있다. 이를 보완하기 위해 비침습적으로 측정할 수 있는 방법을 찾고자 했으며, 결과적으로는 눈물 내 포도당 농도를 측정할 계획을 세웠다. 눈물 내 포도당 농도는 혈당 농도와 비례 관계를 유지하는 것으로 알려져 있다. 그러나 이 때 눈물 내 포도당 농도의 변화는 매우 미미하고 혈당에 비해 훨씬 낮은 농도를 포함하고 있다. 이를 감지하기 위해서 미세한 눈물 속 포도당을 감지할 수 있는 나노 소재의 필요성이 대두되었다. 이에 포도당산화효소 역할을 대체하는 금 나노 입자를 사용하였다. 구연산 (citrate)으로 표면을 둘러싼 금 나노 입자가 포도당 산화효소 활성을 가진다는 선행 연구가 존재하였기에, 이러한 금 나노 입자를 활용해 포도당을 간단하게 측정할 수 있는 플랫폼을 만들고자 하였다. 전기화학적신호를 분석하는 기존의 센서와는 달리, 가정에서 편하게 측정할 수 있는 방법으로 비색계 측정법을 활용하였다. 포도당과 반응해 과산화수소를 생성하는 금 나노 입자와, 생성된 과산화수소와 반응해 3가 에서 4가 입자로 변하며 발색변화를 나타내는 산화 세륨 나노 입자를 이용하여 포도당 농도의 변화에 따라 색상이 변하고, 이를 눈으로도 쉽게 감지할 수 있게 하고자 했다. 먼저 금 나노 입자를 합성하였으며, TEM과 UV -vis spectrum을 통해 이를 확인했다. 캡핑제의 종류와 나노 입자의 크기가 금 나노 입자가 가지는 효소 활성에 영향을 미치는지 여부를 확인하기 위해 과산화수소 측정 실험을 진행하였다. 이후 CCK, LDH 시험 등을 통해 세포독성 여부를 판단하였다. 본 연구를 통해 추가적인 장치, 혹은 색소나 유기물의 사용 없이 오로지 나노 입자만을 사용하여 포도당 농도를 감지하고 발색 변화로 쉽게 관찰할 수 있는 방법을 고안하였다. 더 나아가 기존에 사용하던 금 나노 입자보다 입자의 크기를 작게 하여 감도를 증가시켰다. 결과적으로는 눈물 내 포도당 농도를(0.1-0.6 mM) 발색 변화로 감지할 수 있는 나노 입자 기반의 센서 플랫폼을 제작했다. 이것은 세포독성이 거의 없고, 나노 입자로만 구성되어 있어 대량생산 및 보관이 용이하기에 추후에 렌즈 등 눈에 직접 닿는 여러 가지 당 측정 센서에 적용될 수 있을 것이다.; Diabetes Mellitus (DM) is a popular disease nowadays. Patients with diabetes or pre-diabetes need periodic blood glucose measurements to maintain normal condition. Currently, the most popular blood glucose meter is a method of measuring blood glucose electrochemically by pricking a finger with a needle. This conventional blood glucose meter contains glucose oxidase which is sensitive to changes in temperature and pH, easily denatured and expensive. To make up for this, I was thinking about replacing the enzyme role with nanoparticles. On the other hand, the sensor for measuring blood glucose is invasive, so it causes pain and there is a risk of infection. Since it is already known that glucose concentration in the tear forms a proportional relationship with blood sugar, I planned to detect tear glucose which can be measured noninvasively. However, the glucose change in tears is very slight and much lower than in blood. To detect these slight changes, nanomaterial capable of detecting minute tear glucose is needed. Thus, gold nanoparticle was selected as a substitute of glucose oxidase in this research. Previous studies have shown that citrate-capped AuNP has glucose oxidase-mimicking activity. Also, according to research results, these nanoparticles are more sensitive to glucose than glucose oxidase. Therefore, it is possible to detect glucose at a low concentration. In this study, I made a system which can detect tear glucose by some colorimetric change so that it can be measured with human eyes. Citrate-capped gold nanoparticles which mimic glucose oxidase activity were first synthesized. The aspects that affect glucose-oxidase mimicking activity of gold nanoparticles such as capping agents and the size were analyzed and optimized for better sensitivity to glucose. With an assay for H2O2, it was confirmed that citrate is the most suitable capping agent for glucose detection. Also, it was confirmed that the smaller the particle sizes of AuNP, the greater the reactivity of glucose. The smallest size of citrate-capped AuNP with 3.5 nm in diameter was selected and proved that it has no cytotoxicity through cytotoxicity tests such as CCK and LDH assays. To detect tear glucose concentration by checking the color change with naked eyes, cerium oxide particles were used because they exhibit color change by reacting with H2O2 which was produced when gold nanoparticles react with glucose. This allows patients to identify glucose levels with naked eyes by simply observing color changes. Overall, this platform is sensitive, nontoxic so it can be further used as non-invasive biosensors for detecting tear glucose.