Development of therapeutic gene delivery systems for ischemic stroke therapy

Abstract

뇌졸중은 뇌로 향하는 혈류의 공급에 이상이 생겨 뇌세포에 손상을 주는 질병으로써, 크게 뇌혈류의 감소로 인해 발생하는 허혈성 뇌졸중과 출혈에 의한 출혈성 뇌졸중으로 나누어진다. 일반적인 허혈성 뇌졸중 치료법으로는 혈전용해치료로 뇌혈류를 회복시키는 방법이 있다. 그러나 뇌혈류를 회복하면서 발생하는 허혈-재관류 손상에 의해 추가적인 뇌손상을 입게 된다. 그러므로 허혈-재관류 손상으로부터 뇌세포를 보호하는 추가적인 치료법을 요구한다. 본 연구에서는 여러 치료유전자 전달 체계를 통해 허혈-재관류 손상으로부터 뇌세포를 보호할 수 있음을 세포 및 동물 모델에서 평가하였다. 대뇌로 치료유전자를 전달하기 위해, 먼저 각 유전자 전달체의 전달효율 및 생체적합성을 평가하였다. 저분자량 폴리에틸렌이민 (2 kDa, PEI2k)에 덱사메타손을 접합시킨 유전자 전달체 (PEI-Dexa), 아르기닌과 발린으로 이루어진 유전자 전달체 (R3V6)는 대뇌에 유전자를 전달하기 위해 연구되었다. 한편, 디옥시콜산은 쉽게 세포막과 결합할 수 있고, 유전자를 에너지 독립적으로 전달할 수 있기 때문에, 폴리에틸렌이민에 디옥시콜산이 결합된 유전자 전달체 (DP2k)를 합성했다. 그래서, D2k를 R3V6, PEI-Dexa와 함께 평가하였다. 신경세포에서의 유전자 전달 효율 실험에서, DP2k가 가장 높은 유전자 전달효율을 보였으며, 세포 내 독성 또한 낮은 것을 확인하였다. 대뇌로의 유전자 전달효율을 평가하기 위해 대뇌에 각 유전자 전달체와 유전자의 복합체를 투여하였다. 그 결과, DP2k가 다른 전달체에 비해 높은 유전자 전달효율을 나타내는 것을 확인하였다. 대뇌에서의 독성 또한 낮은 것을 확인하였다. 이러한 결과들은 세포실험 및 동물실험에서 높은 유전자 전달효율을 보이며, 낮은 독성을 나타내는 DP2k가 대뇌로의 유전자 전달을 위한 유전자 전달체로 이용될 수 있음을 보여준다. 허혈성 뇌졸중의 유전자 치료를 위하여, plasmid heme oxygenase-1 (pHO-1)을 치료유전자로써 전달하였다. HO-1은 heme을 분해하여 세 가지 생성물, 일산화탄소, biliverdin, 그리고 철 이온을 생성한다. 이 생성물들은 항염증 및 항산화 효과가 있기 때문에, 이를 발현하는 유전자를 전달하여 치료효과를 평가하였다. 대뇌로의 pHO-1 전달효율 및 치료효과를 허혈성 뇌졸중 동물모델에서 평가하였다. DP2k가 PEI25k보다 높은 HO-1 발현율을 가지는 것을 확인하였다. 그 결과, 경색부위가 DP2k/pHO-1 그룹이 PEI25k/pHO-1 그룹보다 줄어들었으며, 세포 사멸 역시 감소한 것을 확인하였다. 이러한 결과들은, DP2k를 이용한 높은 pHO-1 전달효율로 허혈성 뇌졸중의 유전자 치료에 이용될 수 있음을 보여준다. 저산소 상태 세포에 효율적인 치료유전자의 전달을 위해, Receptor for advanced glycation end products (RAGE)와 결합하는 Hypoxia-Specific Anti-RAGE Peptide (HSAP)를 DNA 재조합 방법을 이용하여 제작하고 정제하였다. RAGE는 저산소 상태 세포에서 과발현되기 때문에 HSAP는 저산소 세포를 표적으로 하는 것에 이용될 수 있다. 또한, 양이온 전하를 가지는 HSAP는 DNA와 복합체를 형성할 수 있기 때문에, pHO-1, DP2k, 그리고 HSAP로 이루어진 삼중 복합체로 유전자 전달 능력을 평가하였다. 저산소 상태의 신경세포 및 성상세포에서 HSAP-terplex이 DP2k/pDNA보다 높은 유전자 전달효율을 가졌다. 또한, RAGE 신호를 차단함으로써 저산소 상태에서의 세포 보호 효과를 확인하였다. 허혈성 뇌졸중 동물모델에서의 저산소 상태 세포 특이적 유전자 전달 능력을 면역염색법을 통하여 확인하였으며, 치료효과 역시 HSAP가 있는 복합체 그룹이 HSAP 혹은 pHO-1/DP2k 그룹보다 개선된 효과를 보았다. 이러한 결과들은, HSAP를 이용한 RAGE 신호 차단 및 저산소 상태 세포로의 유전자 전달을 통해 치료유전자와의 복합치료를 할 수 있음을 보여준다. 허혈-재관류 손상으로 인한 급성 손상의 효율적인 유전자치료를 위하여, HO1-mRNA를 DP2k 전달체를 이용하여 전달 후, 치료효과를 확인하기 위해 연구하였다. 단백질 발현에 핵으로의 전달이 요구되지 않는 mRNA이기 때문에, DNA에 비해 빠른 단백질 발현을 할 수 있다. 또한, pDNA 전달에 비해 mRNA가 세포 안에서의 면역반응이 낮다. 각 유전자 전달체의 mRNA 전달효율을 측정하였으며, 그 결과, DP2k가 높은 mRNA 전달 효율을 가졌다. pDNA와 비교하여 mRNA 전달을 통해, 빠른 단백질 발현과 낮은 면역반응을 보였고, 허혈성 뇌졸중 동물모델에서의 치료효과를 확인하였다. 그 결과는 pHO1/DP2k 복합체와 비교하여, HO1-mRNA/DP2k 복합체가 효율적으로 감소시킴을 보여 주었다. 결론적으로, 높은 유전자 전달효율과 낮은 독성 때문에, DP2k는 허혈성 뇌졸중 유전자 치료에 알맞은 유전자 전달체일 것이다. 저산소 세포에 효율적으로 치료유전자를 전달하기 위해, HSAP와 함께 유전자를 전달하였고, 이를 통해 저산소 세포 특이적 유전자 전달 체계를 개발하여 개선된 치료효과를 확인하였다. 또한, mRNA 전달은 신속하고 지속적인 유전자 발현을 통하여 급성 손상에 대해 효율적인 유전자 치료로써 응용할 수 있을 것이다.