GDNF에 의한 생쥐 정원줄기세포의 줄기세포 특성 조절에서 Early Growth Response-1 전사인자의 기능

Abstract

Zinc-finger transcription factor인 Early growth response 1 (Egr1)은 Egr2, Egr3, Egr4와 함께 Egr family에 속하는 전사인자로서 다양한 kinase pathway에 의해 발현이 유도되며, 세포 생존, 사멸, 성장, 분화에 필요한 유전자 발현을 조절한다. 세정관의 혈액정소장벽 외곽에 존재하는 정원줄기세포는 혈액 및 Sertoli cell에서 기원한 GDNF, FGF2 등의 성장인자의 영향을 받아 생존하며 자가증식한다. 본 연구에서는 정원줄기세포에서 줄기세포 특성유지 기전규명을 목적으로 1) Egr family 기능 규명을 위해 생쥐 정소 및 정원줄기세포에서 Egr family (Egr1, 2, 3, 4) 발현을 확정하고 2) GDNF 수용체 하위에서 p38 MAPK, PI3K, ERK1/2를 경유한 Egr family의 유도특성 및 줄기세포 특성유지 신호경로를 확인하고, 3) Egr1 KO 생쥐 정원줄기세포에서 Egr family 발현 및 GDNF 신호전달 경로의 변동을 규명하고, 4) Egr 1 KO 정원줄기세포에서 Egr2, Egr3, Egr4에 의한 Egr1 KO 표현형의 기능적보상 (functional compensation) 가능성 규명을 위한 siRNA에 의한 정원줄기세포의 생존, 자가재생, 줄기성 유지 가능성 여부를 확인하고, 5) Egr1 KO 생쥐 정원줄기세포에서 RNA-seq을 통해 Egr1의 결핍에 의해 비정상적으로 조절되는 신호전달경로의 분석 및 GDNF 신호전달 하위에서 Egr1의 전사 조절을 받는 유전체를 분석하였다. 정소의 발생과정에서 Egr1, Egr2 mRNA는 미성숙 시기(1, 6, 7일)에 높게 발현되었고 성숙되면서 감소하였다. Egr1, 3 단백질은 성숙되면서 감소하였고 Egr2는 성숙되면서 증가하였다. 정원줄기세포가 가장 높은 비율로 존재하는 생후 6일령 정소에서 Egr1과 Egr3은 THY-1(+) ID4(+) 정원줄기세포의 핵에서 발현되었고, Egr2는 세포질에서 발현되었다. WT 정원줄기세포에 GDNF 처리 시 Egr1, Egr2, Egr3 mRNA는 증가하였으나 Egr4 mRNA는 변화가 없었고 Lhx1, ID4, Etv5, Bcl6b mRNA가 증가하였다. ERK1/2 inhibitor (U0126)는 Egr1, Egr2, Egr3, Egr4, ID4, Etv5 mRNA를 감소시켰고 GDNF와 동시 처리 시 Egr1, Egr2, Egr3, Egr4, Lhx1, ID4, Etv5, Bcl6b mRNA가 모두 감소하였다. PI3K inhibitor (LY294002)와 GDNF를 동시에 처리 시 Egr1, Egr3, Lhx1 mRNA가 증가하였고, Oct4와 Bcl6b mRNA는 감소하였다. p38 MAPK inhibitor (SB230580)와 GDNF를 동시 처리 시 Egr1, Egr2, Egr3와 생존 및 자가증식 관여 유전자인 Etv5, Bcl6b, Lhx1 mRNA가 증가하였으나 Oct4 mRNA는 차이가 없었다. 생후 6일령 Egr1 KO 생쥐 정소 및 정원줄기세포에서 Egr2 단백질은 감소하고 Egr3 단백질이 증가하였다. 또한 Egr1 KO 정원줄기세포에서는 GDNF 처리 시 Egr2, Egr3, Lhx1, ID4, Etv5 mRNA가 증가하였다. Egr1 KO 생쥐 정원줄기세포에 Egr2 siRNA 처리 시 Etv5, ID4가 WT에 비해 증가하였고, Egr3 siRNA 전처리 후 GDNF 처리 시 WT에 비해 Egr2, Egr4, ID4, Oct4 mRNA가 감소하였다. RNA-seq을 통한 발현강도에 따른 차별 발현 유전자 (DEG) 분석 결과 Egr1 KO SSC에서 Egr1 hetero SSC에 비해 Gpx1, Peg3, Mdn1, Suv39h1, Gjc1 등의 apoptosis process 관련 유전자가 가장 많이 증가하였으며, KO에 GDNF를 처리했을 때 HE GDNF에 비해 Tcf7, Chtop, MAPK6 유전자가 증가하였고, Sumo3, Cnbp 유전자가 감소하였다. KEGG DB 기반 Gene-set enrichment 분석 결과 KO CON 과 HE CON을 비교한 결과 MicroRNAs in cancer, IL-17 signaling pathway, Transctiptional misregulation in cancer, TNF signaling pathway, Chemokine signaling pathway, Tuberculosis 관련 pathway에서 유의한 차이를 보였으며, C/EBPβ유전자의 감소를 확인했다. 결론적으로 Egr1과 Egr3 단백질은 정원줄기세포의 핵에서, Egr2 단백질은 세포질에서 발현된다. GDNF에 의한 정원줄기세포의 생존, 자가재생, 줄기성유지 특성에 ERK1/2 하위에서 유도된 Egr1이 역할을 하며, GDNF에 의한 정원줄기세포의 증식 및 생존 유지에 중요한 PI3K와 정원줄기세포의 증식, 분화 및 세포 사멸에 중요한 p38 MAPK는 Egr1 유도를 간접적으로 억제하는 특성이 있다. 또한 Egr1이 결핍되면 Egr2가 감소하고, Egr3는 증가하며, 세포사멸 관련 유전자의 발현이 증가하고, 면역 및 염증반응 관련 유전자의 발현은 감소한다. 즉, Egr2는 Egr1의 조절을 받고 Egr1 결핍 시 정원줄기세포의 줄기세포 유지 특성은 Egr3에 의해 부분적으로 구제되며, 정원줄기세포에서 Egr1은 GDNF 신호 하위에서 생존, 자가재생, 면역 및 염증반응, 세포사멸에 기능한다.