전립선암세포에서 ATF3ΔZip2가 관여하는 p21Cip1 매개 세포사멸 유도

Abstract

최근 우리 연구실에서는 pyrrolo[2,3-d]pyrimidine 계열인 carbocyclic 유도체의 전립선 암세포에서의 항암활성 연구를 수행하고 있다. 그 중 MCS-C3 가 안드로겐의 민감도와 의존성이 높은 전립선 암세포인 LNCaP 세포에서 농도 특이적으로 apoptosis 를 유도한다는 사실을 규명하였다. 따라서 본 연구에서는 pyrrolo[2,3-d]pyrimidine 계열 물질 중에서 MCS-C3 보다 우수한 항암활성을 가진 물질을 발굴하고자 하였고, MTT assay 스크리닝 등을 통해 우수한 항암활성을 가진 MCS-C22 물질을 발굴하게 되었다. 기존에 연구되었던 MCS-C3 와 새롭게 선정한 MCS-C22 를 전립선 암세포인 LNCaP 세포에 처리하여 이들의 항암활성을 비교해보고, MCS-C22 처리 시 발생되는 세포사멸 유도기전에 대해 연구하고자 하였다. LNCaP 세포에 MCS-C22 를 농도별로 처리하여 MTT assay 를 확인한 결과 MCS-C22 6 μM 에서 cell viability 가 크게 감소한 것을 확인하였다. 특정 농도 6 μM 에서 항암활성을 보인 MCS-C22 를 LNCaP 세포에 처리하여 western blots 과 PI staining, real-time RT-PCR 그리고 siRNA 실험을 통해 apoptosis 유도 기전을 관찰하였다. MCS-C22 6 μM 을 시간별로 처리해본 결과 약물처리 12 시간부터 PARP cleavage 가 나타나면서 apoptosis 가 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 이와 동시에 p21Cip1, p53, ATF3ΔZip2 단백질의 증가와 p21Cip1 의 mRNA level 이 증가함을 확인할 수 있었다. 반면, androgen receptor antagonist 로 작용하는 Flutamide 를 처리하자 p21Cip1, p53, ATF3ΔZip2 단백질이 감소함과 동시에 apoptosis 유도가 확연히 감소하는 것을 확인하였다. 증가되는 p21Cip1, p53, ATF3ΔZip2 가 apoptosis 유도와 어떠한 연관성이 있는지 알아보기 위해 siRNA 를 통한 유전자 knock-down 실험을 해 보았고, p53siRNA 에서 ATF3ΔZip2 의 변화는 없었지만 p21Cip1 이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. ATF3ΔZip2siRNA 에서도 p53 의 변화는 없었지만 p21Cip1 이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 반면 p21Cip1siRNA 에서는 ATF3ΔZip2 의 level 이 증가하는 양상을 보였는데 이를 통해 ATF3ΔZip2 가 p53 처럼 p21Cip1 의 상위인자로서 작용할 가능성을 확인하였다. 또한 MCS-C22 6 μM 을 LNCaP 세포에 24 시간 처리하였을 때 western blots 등을 통해 확인되는 tp21Cip1 이 caspase-3 에 의해 절단되는 truncated p21Cip1 (tp21Cip1) 의 절편임을 규명하였다. 이것으로써 MCS-C22 에 의한 LNCaP 세포의 apoptosis 유도와 p21Cip1 이 관련 있음을 확인하였다. 또한 LNCaP 세포 이외의 다른 전립선 암세포에서 p53 의 상태에 따라 MCS-C22 에 의해 상이하게 유도되는 cell death 패턴을 비교해 보았다. p53-null PC3 전립선 암세포에서는 약물처리 후 24 시간과 48 시간에서 autophagy 가 유도되었고, p53 이 mutation 된 DU145 세포에서 약물처리 후 24 시간에서는 autophagy 가, 48 시간이 경과된 경우에서는 apoptosis 가 유도됨을 확인하였다. 특이하게도 48 시간이 경과된 경우에서 p21Cip1 의 level 이 증가되었으며, 이에 따라 apoptosis 가 유도됨을 확인할 수 있었다. MCS-C22 를 처리한 전립선 암세포에서 p53 의 활성화가 apoptosis 유도와 관련이 있는 것을 확인하였고, p53 이 어떻게 세포사멸을 유도하는지 알아보기 위하여 in silica Docking 실험을 통해 MCS-C22 가 단백질-단백질 상호작용 (PPI) 에서 저해제로 작용하는지를 검토하였다. 그 결과 Pyrrolo[2,3-d]pyrimidine 계열의 물질인 MCS-C22 가 MDMX 의 PPI 저해제로 작용하여 p53 의 활성화를 유도함을 확인하였다. 결론적으로, MCS-C22 가 기존에 연구되었던 MCS-C3 보다 더 강력한 항암활성을 지닌 물질임을 확인하였고, 이러한 MCS-C22 는 p53 이 존재하는 LNCaP 세포에서 MDMX 와의 결합을 통해 특정 농도인 6 μM 에서 p53의 활성을 증가시킨다는 것을 규명하였다. 또한 활성화 된 p53 은 p21Cip1 을 증가시키고, 증가된 p21Cip1 은 caspase-3 에 의해 cleaved 되어 CKI 로서의 작용을 하지 못하여 apoptosis 를 유도를 한다는 사실을 규명하였다.