A Colorimetric CRISPR Assay for Prostate Cancer Antigen 3 Based on Zinc Finger Protein-Induced Gold Nanoparticle Assembly

Abstract

Prostate cancer (PC), the second most common cancer in men and the fifth leading cause of cancer-related death globally, demands accurate and rapid diagnosis. However, the standard biomarker, prostate-specific antigen (PSA), exhibits inconsistences with the cancer state, particularly due to its overexpression in benign prostatic hyperplasia. Recently, prostate cancer antigen 3 (PCA3), a long non-coding RNA (lncRNA) regulating cancer- specific gene transcription, has emerged as an alternative diagnostic marker for PC. Here, I demonstrate a selective and convenient assay for PCA3 expression using CRISPR/Cas12a (LpCpf1)-mediated, zinc finger (ZnF)-induced gold nanoparticle (AuNP) colorimetry. This assay utilizes a biotinylated DNA probe serving dual roles as ZnF-binding site and a substrate for CRISPR/Cas12a trans-cleavage. Upon PCA3 recognition by the CRISPR/Cas12a system, ZnF protein was released from streptavidin-coated magnetic beads, triggering a rapid color change from red to violet via self-assembly of AuNP in solution. The self-assembly was driven by the strong electrostatic interaction between the positively charged ZnF and negatively charged AuNPs. Notably, this assay achieved clear color distinction between PCA3-expressed LNCaP cells and PCA3-deficient controls with a detection limit of as low as 0.90 nM. Collectively, this approach holds significant promise as a versatile colorimetric platform for the detection of both coding and non-coding RNAs in clinical diagnostics.|전 세계 남성들 중에서 전립선암 (prostate cancer, PC)은 두 번째로 빈번하게 발생하고 있고, 암으로 인한 사망에서는 다섯 번째로 많은 비중을 차지하고 있기 때문에 정확하고 신속한 진단이 매우 중요하다. 그러나 PC 진단을 위해 널리 사용되고 있는 표준 바이오마커인 전립선 특이 항원 (prostate-specific antigen, PSA)은 전립선 비대증에서도 과다 발현되어 암 진단의 정확성이 결여되어 있다. 최근 암 특이적인 유전자 발현 조절에 관여하는 long non-coding RNA (lncRNA)인 전립선암 항원 3 (prostate cancer antigen 3, PCA3)가 PC의 대체 진단 바이오마커로 주목받고 있다. 본 연구에서는 CRISPR/Cas12a (LbCpf1)와 징크 핑거 단백질 (ZnF)을 활용하여 유도되는 금나노입자 (gold nanoparticle, AuNP)의 응집과 색변화를 기반으로 PCA3 발현에 대한 높은 선택성과 편리한 분석법을 제안한다. 이 방법에서는 ZnF 결합 부위와 CRISPR/Cas12a 전사 절단 기질의 이중 역할을 하는 바이오틴화된 DNA probe를 사용하여 CRISPR/Cas12a에 의해 PCA3가 인식되면, DNA 프로브가 절단되어 ZnF 단백질이 streptavidin이 부착된 자성 비드에서 방출된다. 이러한 결과는 양전하를 띠는 ZnF와 음전하를 띠는 AuNP사이의 강한 정전기적 상호작용에서 기인한 것이며 AuNP의 응집은 반응 용액을 빨간색에서 보라색으로 변화시킨다. 그 결과, 본 방법은 PCA3가 과발현된 LNCaP 세포주와 PCA3가 결핍된 대조군 세포주들 사이에서 낮은 농도에서도 명확한 색 변화 차이를 보여주었으며, 검출한계는 0.90 nM으로 측정되었다. 결론적으로, 본 연구에서 제안한 측정법은 다양한 종류의 핵산을 손쉽고 효과적으로 검출하기 위한 비색기반 플랫폼으로서 임상 진단에서 널리 활용될 수 있을 것으로 기대한다.