Exploring α-Arrestin Interactomes in Human and Drosophila and Investigating the Transcriptomic Landscape in Drosophila Hematopoiesis and Immune Response

Abstract

본 연구에서는 대량 신속 처리된 multi omics 데이터를 활용하여 arrestin 패밀리 단백질 중 하나인 α-arrestin에 대한 연구를 인간과 초파리에서 진행하고 초파리 애벌레 발달 과정 및 면역 반응에서 생기는 hemocyte의 전사체 다이내믹스를 연구하였음. α-arrestin 은 다목적 단백질로서 여러 신호 전달 체계, 특히 G-protein coupled receptor를 조절하는 것으로 보고됨. 몇몇 α-arrestin에 대한 연구가 진행됐지만 제한적인 부분에서만 깊게 연구 돼있음. 해당 단백질은 여러 종에서 보존 돼있기 때문에 보존돼 있는, 혹은 종 특이적인 α-arrestin의 기능 연구는 이들에 대한 이해를 높일 것이고 다양한 신호 전달 체계를 조절하고 여러 질병과 연관돼 있는 만큼 이들에 대한 통합적인 연구는 기초 연구로서뿐만 아니라 치료학 부분으로 까지 응용이 가능할 것으로 기대됨. 이를 위해 대량 신속 처리된 α-arrestin의 affinity purification 후 질량 분광 분석법을 통해 생산된 데이터를 이용해 상호작용하는 단백질을 동정하였고 전산학적 및 통계적 분석을 통해 신뢰도 높은 단백질 상호 작용 네트워크를 구성하였음. 인간과 초파리에서의 α-arrestin 상호 작용 네트워크 비교 분석을 통해 보존돼 있는 기능들을 확인하였고, 기존에 알려져 있던 ubiquitination에 의한 단백질 분해 기작 뿐만 아니라 RNA splicing 과 같은 새로운 기능이 두 종 모두에서 보존 돼있다는 것을 확인하였음. 이중 인간 유래 α-arrestin 중 하나인 ARRDC3 가 RNA splicing 과 연관 돼있음을 확인하였고 이를 public data와 본 연구진에서 생산한 대량 신속 처리된 RNA sequencing 데이터로 간접적이지만 연관성을 검증하였음. 다음으로 인간 특이적인 기능에 대한 검증을 진행하였음. 인간 유래 α-arrestin 중 하나인 TXNIP과 histone deacetylase 복합체와의 상호작용 검증 및 연관성을 조사하기 위해 대량 신속 처리된 Assay for transposase-accessible chromatin using sequencing (ATAC-seq) 및 RNA-seq 데이터를 생산하였고, TXNIP의 유전자 발현이 억제됐을 때 상당 수 유전자의 발현이 억제되고 프로모터 부분의 chromatin accessibility 가 감소하는 것을 확인하였으며, CD22과 L1CAM 두 유전자의 프로모터에서 HDAC2 단백질의 결합이 유의미하게 증가함을 밝혀 냈음. 또다른 인간 유래 α-arrestin 인 ARRDC5는 V-type ATPase 들과 강하게 상호작용하는 것을 확인하였고, 이들이 중요한 역할을 하는 마우스 유래 osteoclast 세포의 분화와 뼈 재흡수 기능 및 plasma membrane 으로 의 이동을 유도한다는 것을 실험적으로 검증하였음. 초파리 유래 α-arrestin 중 하나인 Vdup1 은 초파리 애벌레에서 발현하는 전구 세포에서 강하게 발현함을 확인하였고 RNA splicing 복합체와 상호작용하고 있음을 확인하였기 때문에 해당 모델 생물에서 전사체 다이내믹스 연구를 진행함. 또한 기존 선행 연구에서 초파리 hemocyte (초파리 혈액 세포) 중 하나인 lamellocyte 가 면역 반응 (말벌에 의한 감염)에 의해 급격히 증가할 때 일부 비 번역 RNA (lncRNA)를 강하게 발현함을 확인하였음. 알려져 있는 비 번역 RNA 뿐만 아니라 추가로 알려지지 않은 비 번역 RNA 들이 면역 반응에서 증가하는 lamellocyte의 기능과 연관돼 있을 것이라는 가설을 세웠고 이를 검증하고자 하였음. 분석을 위해 차세대 염기 서열 분석 (next-generation sequencing) 데이터와 3세대 염기 서열 분석 (3rd generation sequencing) 데이터를 동시에 활용하는 하이브리드 전사체 구축 파이프라인을 고안하였고 두 분석 기술의 단점을 보완하고 장점을 극대화함으로써 보다 정확한 transcript 구조를 예측할 수 있었음. 해당 파이프라인을 통해 업데이트 된 유전지 모델을 바탕으로 단일 세포 레벨에서 다양한 세포 타입 특이적인 lncRNA 마커를 발굴할 수 있었고 현재 Lamellocyte lncRNA 마커에 대한 발현 및 기능을 실험적으로 검증하고 있음. 3세대 염기서열 분석은 RNA의 전장 분석이 가능하다는 장점이 있고 이를 활용하여 이소체 수준에서의 차등 발현 분석 및 fusion gene 분석을 진행하였음. 말벌 감염 상태에서 혈액 유래 hemocyte 간의 이소체 변화가 가장 크게 나타난 것을 확인하였고 이들의 패턴과 일부 후보군의 검증을 진행하고 있음. 마지막으로 fusion gene 분석을 통해 2개 이상의 유전자가 fusion 되는 현상을 확인하였고 약 30 개정도의 fusion gene을 검출할 수 있었음. 특히 Prophenoloxidase 2 와 CG13743 유전자와의 fusion 현상이 모든 샘플에서 높은 빈도로 관측됐고 이를 포함해 5개 fusion gene에 대해 Polymerase chain reaction을 이용한 실험적 검증을 진행하고 있음. 정리하면 대량 신속 처리된 multi-omics 데이터를 활용해 α-arrestin 단백질의 상호 작용 네트워크 구축 및 진화적 관점에서의 보존 및 분화된 기능에 대한 분석을 진행하였고, 초파리 애벌레의 면역 반응에 의해 변화하는 전사체 다이내믹스를 초파리 면역세포에서 체계적으로 분석하였고 fusion gene, 이소체 차등 발현 및 lncRNA와의 연관성을 연구하였음. |This research explores the intricacies of α-arrestins and their protein-protein interactions, as well as investigates the Drosophila immune system and the potential influences of non-coding RNAs on lamellocyte development. The α-arrestins are evolutionarily conserved modulators that have been reported to control diverse signaling pathways, particularly G-protein coupled receptors. A few mammalian α-arrestins and those conserved in yeast and Drosophila have been studied of their protein interactors and functions. However, substantial part of interactome and biological functions of α-arrestins from diverse species remain largely uncharacterized. Employing affinity purification and mass spectrometry, we constructed protein-protein interaction networks for six human and twelve Drosophila α-arrestins. This analysis yielded high-confidence interactomes with hundreds of prey proteins for each species, indicating conserved and species-specific interactions. Notably, we found that the human α-arrestins ARRDC3 and Drosophila α-arrestins Vdup1 and CG18746 interacts with orthologous proteins involved in RNA splicing. Analysis of RNA-seq of HeLa cells under ARRDC3, TXNIP and splicing factors depleted conditions showed that perturbation of ARRDC3 influences certain type of alternative RNA splicing, a degree of which was comparable to splicing factor depleted conditions. In addition to conserved interactome, we found that human α-arrestins, TXNIP, influences chromatin structures and transcription signals by obstructing HDAC2 recruitment. Additionally, analysis of the interactome for the uncharacterized human α-arrestins ARRDC5 revealed a link to the key bone resorption regulator, V-type ATPase. Meanwhile, we also focused on the Drosophila immune system, particularly hemocytes and their progenitors, prohemocytes. With the use of both Illumina short- and Nanopore long-read sequencing, we generated integrative hybrid transcriptomes, leading to the identification of novel non-coding RNAs, distinctly expressed in lamellocytes that are induced upon wasp infestation. Furthermore, we noticed a potential shift in alternative splicing and isoform usage under infested conditions, which we are further investigating at the bulk and single-cell levels. Fusion genes identified from our long-read RNA-seq data are also currently under experimental validation. In summary, our research provides a valuable resource for understanding α-arrestins’s cellular functions, discovers novel non-coding RNA markers in response to immune challenges, and illuminates the changes in alternative splicing and isoform usage in Drosophila larvae.