단백질 N-말단 포밀화 감지 형광 리포터 제작을 통한 진핵생물 단백질 N-말단 포밀화의 생리적 기능 연구

Abstract

Protein synthesis in bacteria and eukaryotic cell organelles such as mitochondria and chloroplasts initiates from the N-terminus of the protein, which is formulated from the modified amino acid formylmethionine (fMet). The formyltransferase (Fmt1) of Saccharomyces cerevisiae is synthesized in the cytoplasm and functions within the mitochondria. Fmt1 initiates the translation of proteins by using 10-formyltetrahydrofolate (10-fTHF) as a substrate to bring in the fMet-tRNA with N-terminal formylation. N-terminal formylation is a type of pretranslational chemical modification, and subsequently, the formyl group is removed by a peptide deformylase bound to the ribosome. However, recent studies have reported that in the eukaryotic organism S. cerevisiae, under stress conditions such as stationary phase or depletion of specific amino acids, Fmt1 can be formylated by Gcn2 kinase, leading to its retention in the cytoplasm and synthesis of proteins with N-terminal formylation. These N-terminal formylated proteins generated in this manner act as N-degrons, following the fMet/N-degron pathway, which leads to their degradation via the ubiquitin-proteasome system. This process has been shown to play a crucial role in the adaptation and survival of S. cerevisiae under specific stress conditions. However, the association between N-terminal formylated proteins and their physiological changes remains unclear, and there is no method for specifically monitoring only N-terminal formylated proteins, making these studies more difficult. In this study, we aimed to monitor the dynamics of N-terminal formylated proteins with higher sensitivity by using the tripartite-split GFP system. Firstly, we constructed an N-terminal formylated protein interaction fluorescent reporter using SSB2, a protein belonging to the Hsp70 family that interacts with E3 ubiquitin ligase Psh1, known to be involved in the degradation of N-terminal formylated proteins. Using the generated fluorescent reporter, we were able to observe an increase in the production of N-terminal formylated proteins at 48 hours compared to 24 hours under histidine depletion conditions. Additionally, to monitor the intracellular localization changes of Fmt1, which plays a crucial role in formylation, we constructed a cytosolic-targeted fluorescent reporter based on the split GFP system. By analyzing individual cells, we measured the changes in fluorescence through the produced fluorescent reporter, allowing us to confirm the intracellular localization of Fmt1 in mitochondria or the cytosol. Furthermore, we were able to observe changes in the intracellular localization of Fmt1 in the cytosol over the course of the culture period. Based on this, we investigated the localization changes of Fmt1 in the cytoplasm of S. cerevisiae under histidine-depleted conditions, which have been reported to increase the expression of N-terminal formylated proteins. Interestingly, we observed an increase in the abundance of Fmt1 after 48 hours, compared to 24 hours. Additionally, we were able to confirm a slight increase in the amount of Fmt1 in the cytoplasm under tryptophan-depleted conditions. Next, we conducted a study on the physiological changes mediated by N-terminal formylated proteins. First, we cultured S. cerevisiae cells under amino acid depletion conditions for 24 hours and 48 hours to examine the cell cycle at each time point. As a result, we consistently observed an inability to progress to the 2n state. Considering the potential implications of these physiological changes, such as increased cell death and apoptosis, we measured cell viability and apoptosis under the same conditions. The results revealed a higher incidence of cell death after 48 hours compared to 24 hours under histidine depletion conditions, indicating an association between N-terminal formylated proteins and cell viability through an increased ratio of apoptosis. Lastly, to identify the genes responsible for these physiological changes, we performed quantitative proteomic analysis on S. cerevisiae cells cultured under histidine depletion conditions for 24 hours and 48 hours. The results showed that as the culturing time progressed, genes involved in stress response and genes related to localization and proteolysis were upregulated. Conversely, genes associated with transport were downregulated. Therefore, under stress conditions such as histidine depletion, S. cerevisiae cells exhibit a complex upregulation of genes involved in stress response and genes related to localization, in addition to Gcn2. This results in the retention of Fmt1 in the cytoplasm, leading to an increase in the abundance of N-terminal formylated proteins in the cytoplasm. Consequently, various physiological changes including cell cycle, cell viability, and apoptosis are induced, enabling the cells to respond to stress. |박테리아와 진핵생물의 세포소기관인 미토콘드리아와 엽록체에서는 N-말단이 포밀화가된 아미노산인 포밀메티오닌(fMet)으로부터 단백질 합성이 시작된다. Saccharomyces cerevisiae의 포밀트랜스퍼라제(Fmt1)는 세포질에서 합성되어 미토콘드리아에서 작용한다. Fmt1은 10-formyltetrahydrofolate (10-fTHF)를 기질로 사용하여 N-말단이 포밀화가 되어 있는 fMet-tRNA을 가져옴으로 써 단백질의 번역이 개시된다. N-말단 포밀화는 일종의 번역 전 단백질 화학적 변형(pretranslational chemical modification)이며, 이후 리보솜에 결합된 펩타이드 디포밀라이제(peptide deformylase)에 의해 포밀기가 제거 된다. 그러나 최근 진핵생물인 S. cerevisiae의 세포가 stationary phase 또는 특정 아미노산의 고갈과 같은 스트레스 상황에서 Fmt1이 Gcn2 kinase에 의해 인산화 되고 세포질에 남게 되어 세포질에서N-말단이 포밀화된 단백질이 합성될 수 있다. 이렇게 세포질에서 생성된 N-말단 포밀화 단백질은 N-degron으로 작용해 ubiquitin-proteasome system을 통해 분해가 되는 fMet/N-degron pathway를 따르며, 이는 S. cerevisiae가 특정 스트레스 상황에 적응하고 생존함에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. 하지만 N-말단 포밀화 단백질과 이들에 의한 생리적인 변화와의 연관성에 대해서는 밝혀지지 않았으며, N-말단 포밀화 단백질만 특이적으로 모니터링을 할 수 있는 방법이 없기에 이러한 연구를 더욱 어렵게 만들고 있다. 본 연구에서는 tripartite-split GFP system을 도입하여 N-말단 포밀화 단백질의 변화 양상을 보다 높은 감도로 모니터링 하고자 하였다. 먼저 N-말단 포밀화 단백질의 분해에 연관이 있는 E3 ubiquitin ligase Psh1 과 상호작용 하며, protein binding, 스트레스에 대응하는 단백질인 Hsp70 family중 하나인 SSB2를 이용하여 N-말단 포밀화 단백질 상호작용 형광리포터를 제작하였다. 제작한 형광리포터를 통해 히스트딘 고갈조건에서 24시간에서 보다 48시간에서 N-말단 포밀화 단백질의 생성이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 그리고 포밀화에 중요한 역할을 하는 Fmt1의 세포질 내 위치 변화를 모니터링 하고자 split GFP system 기반으로 하여 세포질 타겟 형광리포터를 제작하였다. 유세포 분석을 이용하여 제작된 형광리포터를 통해 형광의 변화를 측정하여 미토콘드리아 또는 세포질에서 Fmt1의 세포 내 위치를 확인 할 수 있었고, 배양 시간에 따라 세포질 내의 Fmt1의 위치 변화를 알 수 있었다. 이를 기반으로 S. cerevisiae의 세포질에서 N-말단 포밀화 단백질을 증가시키는 것으로 보고된 히스티딘 고갈 조건에서 Fmt1의 위치변화를 확인하였으며, 흥미롭게도 24시간 보다 48시간에 Fmt1의 양이 증가함을 확인 하였으며, 추가적으로 트립토판 고갈 조건에서도 세포질에서 Fmt1의 양이 다소 증가함을 확인 할 수 있었다. 다음으로 N-말단 포밀화 단백질에 의한 생리적 변화에 대한 연구를 진행하였다. 우선 S. cerevisiae 세포를 아미노산 고갈조건에서 24시간, 48시간 배양시켜 각 배양 시간대 별 세포주기를 확인하였다. 그 결과 공통적으로 2n 상태로 온전히 들어지 못함을 확인 할 수 있었다. 이와 같은 생리적 변화로 인해 cell death 및 apoptosis가 늘어 날 수 있기에 동일 조건에서의 cell viability와 apoptosis를 측정하였고, 그 결과 히스티딘 고갈조건에서 24시간 보다 48시간에서 cell death가 더 늘었고, apoptosis의 비율을 증가함을 통해 N-말단 포밀화 단백질과 cell viability와의 연관성을 확인 할 수 있었다. 마지막으로 이러한 생리적인 변화를 일으키는 유전자를 찾고자 히스티딘 고갈 조건에서 24시간, 48시간 배양시킨 S. cerevisiae 세포를 단백질체 정량 분석을 실시하였고, 그 결과 배양 시간이 경과됨에 따라 스트레스에 반응하는 유전자와 localization 및 proteolysis에 관여하는 유전자가 상향 조절되었고, 반대로 transport와 관련된 유전자는 하향 조절 되는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서 히스티딘 고갈 상황과 같은 스트레스 상황에서 S. cerevisiae세포는 Gcn2 이외에 스트레스에 반응하는 유전자 및 localization에 관여하는 유전자들이 복합적으로 상향 조절 되어 Fmt1이 세포질에 잔류하게 되고, 이로 인해 세포질에서 N-말단 포밀화 단백질의 양이 증가되어 세포주기, cell viability, apoptosis 등 여러 생리적인 변화를 유도하여 스트레스에 대응하는 것으로 사료된다.