핵자기공명법을 이용한 Apo B-100 유래 생체모방 펩티드 (P100, P102, P103)의 구조 연구

Abstract

LDL (Low density lipoprotein)을 구성하고 있는 주요 단백질 성분인 apo B-100 (Apolipoprotein B-100)은 4,536개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 혈중 콜레스테롤을 운반하는 LDL에서 세포의 LDL receptor와 결합하는 역할을 한다. LDL은 MDA (Malondialdehyde)나 아세틸화에 의해 산화되고, 산화된 LDL과 apo B-100은 peptide 구조의 변형으로 LDL receptor와 결합이 되지 않으며, 정상적인 콜레스테롤 분해가 이루어지지 않고 내피 아래에서 플라크를 형성하여 축적을 일으켜 동맥경화 유발의 주요 원인이 된다. Apo B-100의 4,536개 아미노산 서열을 P1-P302로 20개씩 조합하고, MDA 처리로 산화시킨 후 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 분석 실험을 통해 7개의 그룹으로 분류하였다. 본 연구에서는 MDA처리 후 IgM (Immunoglobulin M) 수치가 높게 나타나는 B 그룹에 속하는 peptide인 P100 (RLNGE SNLRF NSSYL QGTNQ), P102 (SLTST SDLQS GIIKN TASLK), P103 (TASLK YENYE LTLKS DTNGK)에 대해 구조 분석 연구를 하였다. 구조 정보를 얻기 위해 우선 CD (Circular dichroism)를 측정하였다. CD의 결과 spectrum을 해석한 결과 P100과 P103은 α-helix 구조와 random coil 구조가 혼합된 구조를 가질 것이며, P102는 random coil 구조와 β-turn 구조가 혼합된 구조를 가질 것으로 나타났다. NMR (Nuclear magnetic resonance)로 1H-NMR 및 2D NMR의 COSY (Correlation spectroscopy), TOCSY(Total correlation spectroscopy), NOESY (Nuclear overhauser effect spectroscopy)를 측정하였다. NMR 실험으로 얻어진 spectrum으로 peak의 chemical shift를 assignments하고, NOESY spectrum으로 각 peptide의 아미노산 잔기들의 intraresidual과 1H-1H의 거리정보인 NOE connectivity를 얻어 구조 결정에 활용하였다.

NMR spectrum으로 peak를 assignments할 때, 신호 지정을 위해 HANSAT (Hanyang Automated NMR Signal Assignment Tool)의 Ver.2를 개발하였다. HANSAT은 완벽한 신호 지정을 위해 NMRViewJ (One Moon Scientific Inc.)의 peak pick기능과 Microsoft Office Excel S/W의 advanced filter와 macro를 이용하였다. 이들을 연동시켜 비슷한 chemical shift 값을 가진 peak들을 빠르게 찾을 수 있도록 한 것으로, 한 아미노산의 잔기와 상호작용을 하는 peak들은 x축 또는 y축의 좌표 값이 거의 같아 한 선상에 있음을 응용하였다. 겹쳐있는 peak들에 대해서는 HANSAT(Ver.2)에서 x값의 범위를 좁혀서 재검색을 하거나 spectrum의 contour level을 조절함으로써 해결할 수 있었다. NMR spectrum에서 얻어진 정보들을 바탕으로 DG (Distance geometry)와 MD (Molecular dynamic)를 실행하여 최종 구조를 결정하였다. 최종 구조를 얻기 위해 임의의 구조에서 얻어진 정보로 NOE back calculation을 수행하여 결정한 구조가 NOE spectrum과 일치하게 계산되는지 확인하고, 일치할 때까지 MD를 실행하였다. 최종 결정된 구조는 stereoview 3차 구조와 surface charge를 확인하였다. P100은 α-helix 구조를 가지고, P102는 약간의 α-helix 구조를 가지지만, β-turn 구조와 random coil 구조가 나타났으며, P103은 α-helix 구조와 random coil 구조가 나타났다. 단백질 구조 연구에서 중요하게 사용되는 Ramachandran plot도 확인하였다. P100은 Glu[5], Ser[12], Tyr[14], Asn[19]가 α-helix region에서 나타났고, P102는 Thr[5]와 Ile[13]이 β-sheet region에 나타났으며, P103은 Ser[3], Lys[5], Glu[7], Asn[8], Tyr[9], Lys[14], Ser[15], Asp[16], Thr[17]이 α-helix region에서 나타났다. Apo B-100의 구조 연구는 7개의 group의 모든 peptide 구조와 산화처리 후의 구조, 그리고 surface charge를 이용한 binding site 파악 등의 규명이 이루어지면, 동맥경화의 예방과 치료에 중요하게 응용될 것이다. 동맥경화의 예방과 치료를 위해 LDL의 산화 자체를 막거나 산화된 LDL을 분해할 수 있는 기능을 개발하는 연구 등의 기초 자료로 활용 될 수 있을 것이다.|Apo B-100 (Apolipoprotein B-100), the main protein component that makes up LDL(Low density lipoprotein), consists of 4,536 amino acids and serves to combine with the LDL receptor of cells in LDL, which carrying blood cholesterol. LDL is oxidized by MDA or acetylation, and the oxidized LDL and Apo B-100 are not bound to the LDL receptor due to modification of the peptide structure. Then, normal cholesterol is not degraded and plaques form under the endothelium, causing accumulation, which is a major cause of atherosclerosis. By selecting sequential 20 amino acids out of the 4,536 amino acid sequences of Apo B-100, peptide groups P1-P302 were designated. ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) analysis experiments after MDA treatments for these peptide groups gave rise to 7 different groups. In this study, structural analysis was performed on P100, P102, and P103 peptide belonging to group B where IgM levels are high after MDA treatment. The CD (Circular dichroism) experiments were measured to obtain secondary structural information. CD spectral analyses showed that P100 and P103 have a mixed structure with the α-helix structure and random coil structure, and P102 have a mixed structure with the random coil structure and β-turn structure. Complete NMR signal assignments were made by using 2D-NMR techniques including, COSY(correlation spectroscopy), TOCSY(total correlation spectroscopy), and NOESY (nuclear overhauser effect spectroscopy). With the NOESY spectrum, the intraresidual and the distance information of 1H-1H of the amino acid residues of each peptide were obtained and utilized for structural determination. For convenient NMR signal assignments, HANSAT (Hanyang Automated NMR Signal Assignment Tool) Ver.2 was developed. For complete signal designations, HANSAT uses NMRViewJ (One Moon Scientific Inc.)'s peak pick feature and Microsoft Office Excel S/W advanced filter and macro. By linking them, we were able to quickly find peaks with similar chemical shift values, and the coordinates of the x,y-spectral dimension originated from a amino acid are aligned. Overlapping peaks are quickly resolved by narrowing the range of x values ​​or adjusting the contour level of the spectrum in HANSAT. Based on the information obtained from the NMR spectrum, DG and MD were executed to determine the final structure. To obtain the final structure, NOE back calculation was performed with information obtained from any structure to ensure that the determined structure was calculated in accordance with the NOE spectrum, and MD was run until it was matched. The stereoview tertiary structure and surface charge were obatained for final NMR structure. P100 has pseudo α-helix structure, P102 has some pseudo α-helix structure, but β-turn structure and random coil structure appeared, and P103 showed pseudo α-helix structure and random coil structure. The Ramachandran plot, which is used important in protein structure studies, was also determined. P100 showed Glu[5], Ser[12], Tyr[14], Asn[19] in α-helix region, P102 showed Thr[5] and Ile[13] in β-sheet region, and P103 showed Ser[3], Lys[5], Glu[7], Asn[8], Tyr[9], Lys[14], Ser[15], Asp[16], Thr [17] in pseudo α-helix region. The structural studies of apo B-100 will be important applied for the prevention and treatment of atherosclerosis if all peptide structures of 7 groups, structures after oxidation treatment and identification of binding sites using surface charges are identified. It may be used as basic data such as research to develop functions to prevent oxidation of LDL or to break down oxidized LDL to prevent and treat hardening of arteries.