Organic Hydroperoxide-Sensing Mechanisms in OhrR of Xanthomonas campestris pv. campestris

Abstract

OhrR is an organic hydroperoxide (OHP)-specific sensor found in many bacteria and regulates the expression level of gene encoding a thiol-dependent peroxidase, Ohr, OHP specific defense enzyme. OhrR is classified into two species according to its sensing mechanisms: 1-Cys OhrR and 2-Cys OhrR. The 2-Cys OhrR first found in Xanthomonas campestris pv. phaseoli contains a peroxidatic cysteine and resolving cysteine in each monomer. By the previous studies, it is known that the initially oxidized peroxidatic cysteine (Cys-SOH) by OHP forms an intermolecular disulfide bond with the resolving cysteine of the opposite monomer for inactivation in DNA binding activity. In vivo studies of 2-Cys OhrRXC indicate that both peroxidatic cysteine and resolving cysteine are required for the response against OHP in preceding research. However, there is a lack of deep study investigating the DNA binding activity of OhrRXP corresponding to the oxidative pattern of 2-Cys OhrR like 1-Cys OhrRBS. So, this study is aimed to clarify the association between DNA binding activity and cysteine modification within 2-Cys OhrRXC. Two of the three cysteines found in each monomer of homodimeric OhrRXC, Cys22 and Cys127, have been indicated to function as peroxidatic and resolving cysteine, respectively. Unexpectedly, without the resolving cysteine in vitro, OhrRXC can be inactivated in response to CHP. What's more, after being oxidized to sulfenic acid, OhrRXC can be separated from DNA, and the DNA binding activity is inactivated with no need for any further modifications. The low recovery of DNA binding activity in 1-Cys OhrRXC after excessive CHP treatment explains the role of resolving cysteine in preventing irreversible overoxidation of peroxidatic cysteine. Also, the resolving cysteine can slow down the regeneration rate of OhrR repressor. These in vitro findings are different from the previous in vivo study. Either Cys22 or Cys127-substituted mutation of OhrRXP seemed to result in the loss of DNA-dissociation ability verified by the degree of gene expression. It is unknown whether in vitro results in this thesis are applicable in cellular environments. But if it works in the same way in vivo, in converted 1-Cys OhrR without resolving cysteine, originally 2-Cys OhrR, the little change of expression level may be due to the fast reduction. Furthermore, it is possible that resolving cysteine increases the expression level of ohr gene regulated by 2-Cys OhrR compared to in the absence of resolving cysteine, resulting in an increase in bacterial organic hydroperoxide resistance. |OhrR은 많은 세균에서 발견되는 유기 과산화물(OHP) 특이적 전사인자이며, 티올(thiol) 의존성 과산화효소인 Ohr의 발현 수준을 조절한다. OhrR은 감지 메커니즘에 따라 1-Cys OhrR과 2-Cys OhrR 2종으로 분류된다 X. campestris pv. phaseoli에서 처음 발견된 2-Cys OhrR은 과산화 시스테인과 각 단량체의 분해 시스테인을 포함한다. OHP에 의해 초기에 산화된 과산화 시스테인(Cys-SOH)은 DNA 결합 활성의 불활성화를 위해 반대 단량체의 분해 시스테인과 분자 간 이황화 결합을 형성하는 것으로 알려져 있다. 2-Cys OhrRXC에 대한 생체 내 연구는 과산화 시스테인과 분해 시스테인이 모두 OHP에 대한 반응에 필요함을 나타낸다. 그러나 1-Cys OhrRBS와 같은 2-Cys OhrR의 산화 패턴에 해당하는 OhrRXP의 DNA 결합 활성을 조사하는 심층 연구는 부족하다. 따라서 본 연구의 목적은 OhrRXC 내에서 DNA 결합 활성과 시스테인 변형 사이의 연관성을 면밀히 규명하는 것이다. 각 OhrRXC 단량체에서 발견되는 3개의 시스테인 중 22번 시스테인, 127번 시스테인이 각각 과산화(peroxidatic-), 분해(resolving-) 시스테인으로 기능하는 것으로 나타났다. 또한 선행 연구를 기반한 예상과 다르게, 시스테인의 설펜산(sulfenic acid)로의 산화 단계만을 거쳐 OhrRxC는 CHP에 반응하여 불활성화될 수 있다. 더욱이, OhrRxC는 설펜산으로 산화된 후 DNA로부터 해리되고, DNA 결합 활성은 비활성화되어 더 이상의 변형이 필요하지 않다. 과도한 CHP 처리 후 1-Cys OhrRXC에서 DNA 결합 활성의 낮은 회복은 과산화 시스테인의 비가역적 과산화를 방지하는 시스테인의 역할을 설명한다. 또한 분해 시스테인은 OhrR 억제자의 재생 속도를 늦출 수 있다. 이 결과는 이전 선행 연구들과 대비되는 연구 결과이다. 선행 연구에서는, 22번 시스테인, 또는 127번 시스테인 치환 돌연변이가 DNA 해리 능력의 상실을 유도하는 것으로 보였다. 본 논문의 in vitro 상의 결과가 세포 환경에 적용될 수 있는지는 밝혀지지 않았지만, 분해 시스테인이 없는 경우에 비해 분해 시스테인이 있는 경우, 2-Cys OhrRxC에 의해 조절되는 유전자의 발현 수준이 증가하여 세균의 유기 과산화물 저항성이 증가할 수 있다.