Investigation of Fur Family Proteins from Clostridium pasteurianum

Abstract

Fur (Ferric Uptake regulator) 계열 단백질은 대장균에서 처음 발견된 Fur 단백질에서 그 이름이 유래된 금속 이온 항상성 및 산화 스트레스를 조절하는 박테리아 단백질 그룹이다. Fur 단백질 외에도 다양한 종류의 Fur 계열 단백질이 발견되었다. Fur 계열 단백질에는 Zur (Zinc Uptake Regulator), Mur (Manganese Uptake Regulator), Nur (Nickel Uptake Regulator) 등이 있으며, 이들은 박테리아의 금속 항상성을 조절한다. 과산화수소를 감지하고 조절하는 PerR (Peroxide Regulon Repressor)과 heme 생합성을 조절하는 Irr (Iron Responsive Regulator)도 Fur 계열 단백질에 속한다. 가장 많이 연구된 그램 양성 박테리아인 B. subtilis는 Fur, Zur 및 PerR 총 3개의 Fur 계열 단백질을 가지고 있다. Fur와 Zur는 박테리아에서 흔히 존재하는 단백질이며, PerR은 그램 양성 박테리아에 주로 존재하는 것으로 알려져 있다. B. subtilis 및 S. aureus와 같은 대부분의 그램 양성 박테리아들은 3개의 Fur 계열 단백질을 가지고 있다. 그러나 B. subtilis의 유전적으로 가까운 종인 B. liceniformis의 경우 Fur 1개, Zur 1개, PerR 단백질 3개로 총 5개의 Fur 계열 단백질을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 연구를 통해 여러 개의 PerR 단백질 또는 다른 여러 개의 단백질을 가진 박테리아를 식별하고자 했다.

공기 중의 자유질소를 고정시키고 카르복실산을 생산할 수 있는 절대 혐기성 세균인 C. pasteurianum은 그램 양성 세균이며, 서열 분석을 통해 C. pasteurianum이 CLPA_c26700, CLPA_c21450, CLPA_c32220, 그리고CLPA_c05360까지 총 4개의 Fur family 단백질을 가지고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 우선, 과발현된 대장균 균주를 사용한 MALDI-TOF MS를 통해 PerR의 중요한 특징인 과산화수소에 대한 히스티딘 잔기의 산화를 확인하였다. 그 결과, CLPA_c26700의 T8 tryptic peptide에서는 16 da의 질량 변화가 확인되었으나, T12 tryptic peptide에서는 확인되지 않았다. 또한, CLPA_c21450, CLPA_c32220, CLPA_c05360에서는 질량 변화가 관찰되지 않았다. 다음으로, PerR 유사 단백질로 추정되는 정제된 CLPA_c26700에 대한 PAR 분석이 수행되었다. 과산화수소를 100 mM 정도로 매우 높은 농도로 처리한 경우에도 시스테인 잔기가 완전히 산화되기까지 약 5분이 소요되었다. 이것은 CLPA_c26700이 이전에 알려진 PerR 단백질과 같이 과산화수소를 감지하는 데에 시스테인 잔기를 사용하지 않음을 의미한다. 이와 더불어 정제된 단백질의 금속 의존적 산화 패턴을 확인하였다. 대장균에서의 결과와 마찬가지로, CLPA_c21450 및 CLPA_c32220에서는 산화에 의한 질량의 변화가 관찰되지 않았으나 CLPA_c26700에서 철 이온의 존재 하에 산화에 의한 질량의 변화를 관찰할 수 있었다. 여기에서 주목할 점은 철이 존재할 때는 과산화수소에 관계없이 산화가 일어났다는 것이다. 또한 금속 이온이 없는 경우와 마찬가지로, 망간이 존재할 때는 질량 변화가 관찰되지 않았다. 즉, 철을 통한 펜톤 반응에 의해 히스티딘 잔기에서 산화가 일어났음을 알 수 있었고, 철 이온이 존재할 때에는 완충액이나 공기 중의 산소에 의해서도 산화가 매우 민감하게 일어났음을 확인했다. 다음으로, FA 분석을 수행하여 각 단백질이 특정 DNA 서열에 결합하는지 확인하였다. 50 μM ZnSO4 또는 MnCl2를 100 nM의 DNA probe와 150 nM의 정제된 단백질에 처리하여 anisotropy의 실시간 값을 측정하였다. 그 결과, CLPA_c21450은 Fur box에서만 anisotropy 값의 변화를 보였고, CLPA_c32220은 Zur box에서만 변화가 나타났다.

요약하자면, CLPA_c26700이 PerR 유사 단백질이고, CLPA_c21450이 Fur 유사 단백질이며, CLPA_c32220이 Zur 유사 단백질임을 보여주었다. 그러나 CLPA_c05360의 경우 대장균 균주를 이용한 산화 실험에서 히스티딘 잔기의 산화된 피크가 관찰되지 않았으며, 정확한 기능을 밝히지 못했다는 한계점이 존재한다. 따라서 CLPA_c05360에 대한 추가 실험 및 C. pasteurianum의 Fur 계열 단백질에 대한 in vivo 실험이 추가적으로 필요하다.

본 연구를 통해 C. pasteurianum에서 Fur 계열 단백질을 규명하여 박테리아, 특히 그램 양성 박테리아의 산화적 스트레스 반응 시스템과 금속 이온 항상성 조절 메커니즘을 이해함으로써 산업 미생물의 가공 및 이용에 있어서 새로운 패러다임을 제시하고자 한다. |Fur (Ferric Uptake Regulator) family protein is a group of bacterial proteins that regulate metal ion homeostasis and oxidative stress, named from the first found Fur protein in Escherichia coli. In addition to Fur, various types of Fur family proteins have been discovered. Fur family proteins include Zur (Zinc Uptake Regulator), Mur (Manganese Uptake Regulator), And Nur (Nickel Uptake Regulator) and they participate to regulate metal homeostasis. PerR (Peroxide Regulon Repressor), which detects and regulates hydrogen peroxide in gram-positive bacteria, and Irr (Iron Responsive Regulator), which regulates heme biosynthesis, also belong to Fur family proteins. Bacillus subtilis, the most studied gram-positive bacteria, has a total of three Fur family proteins: Fur, Zur, and PerR. In the case of general gram-positive bacteria, most of them have three Fur family proteins. However, in the case of B. licheniformis, a genetically close species of B. subtilis, it was confirmed that it had one Fur, one Zur, and three PerR proteins.

Clostridium pasteurianum, an absolute anaerobic bacterium that can fix free nitrogen in the air and produce carboxylic acids, is a gram-positive bacterium. It was confirmed that C. pasteurianum has four Fur family proteins through sequence alignment: CLPA_c26700, CLPA_c21450, CLPA_c32220, and CLPA_c05360.

Then, MALDI-TOF MS was performed to confirm the oxidation of histidine residues on H2O2 in E. coli induced the expression of each four protein. As a result, a mass change of 16 da was confirmed in T8 tryptic peptide of CLPA_c26700, but not in T12 tryptic peptide. However, no mass change was observed in CLPA_c21450, CLPA_c32220, and CLPA_c05360. PAR assay was performed on purified CLPA_c26700 estimated to be PerR-like protein. It took about 5 minutes for the cysteine residues to be completely oxidized, even though it treated 100 mM H2O2 at a very high concentration. This means that CLPA_c26700 not uses the cysteine residue to detect hydrogen peroxide. In addition, metal-dependent oxidation pattern of purified proteins was identified. As with the results in E. coli, no mass change was observed in CLPA_c21450 and CLPA_c32220. Corresponding to the results in E. coli, it was possible to observe the mass change only in CLPA_c26700. It is noteworthy that oxidation occurred regardless of H2O2 in the presence of iron in CLPA_c26700. Also, no mass change was observed in the presence of manganese, like in the absence of metal ions. It can be seen that oxidation occurred in the histidine residue by the Fenton reaction through iron. In addition, oxidation occurs very sensitively due to oxygen in the buffer or in the air when iron is present. Next, FA assay was performed to confirm the binding of each protein to a specific DNA sequence. 50 μM ZnSO4 or MnCl2 were treated in 100 nM DNA probe and 150nM purified proteins to measure real-time values of anisotropy. As a result, CLPA_c21450 showed a change in anisotropy value only in the Fur box, and CLPA_c32220 showed a meaningful change only in the Zur box.

These experiments showed that CLPA_c26700 is PerR-like protein, CLPA_c21450 is Fur-like protein, and CLPA_c32220 is Zur-like protein. In the case of CLPA_c05360, the oxidized peak of histidine residues was not observed in the oxidation test in E. coli strain. Therefore, additional in vitro and in vivo experiments on CLPA_c05360 are needed.

It is hoped that this study will present a new paradigm in processing and using industrial microorganisms by identifying Fur family proteins from C. pasteurianum to understand the oxidative stress response system and the mechanism of metal ion homeostasis regulation of bacteria, especially gram-positive bacteria.