Prokaryotic metataxonomics for analysis of field-scale anaerobic digesters and fecal microbiome

Abstract

Diverse biological systems of the Earth harbor microbiota (microbial community) of bacteria and archaea, the prokaryotic microbiota that is being revealed to be a significant constituent of complex biological systems. The ongoing advancement in technological level and efficiency of highthroughput sequencing (HTS) or next-generation sequencing (NGS) technologies in recent years has made the investigation of the immense genetic data present in such microbiomes (the collective genes in a microbial community) possible in individual laboratory scale, in both short-read (e.g., Illumina, Ion Torrent) and long-read (e.g., Oxford Nanopore) platforms. An extensive survey of literature spanning the generations of sequencing technologies and how are the HTS technologies are being utilized for research of various environmental and human microbiomes and their impact were performed, together with prospects on how the rapidly advancing field of HTS need to be utilized in conjunction with other disciplines, mainly for the advancement of anaerobic digestionbased fermentative biohythane (biogas and biohydrogen) production technology.

Among the numerous types of microbiomes present in the biosphere, anaerobic digester and human gut microbiomes have the highly diverse prokaryotic microbiota metabolizing complex types of organic matter under anaerobic conditions in common. In this thesis, various microbiota in fieldscale anaerobic digestion systems producing biogas and the microbiota in neonatal feces for both term and preterm infants were subjected to metataxonomic analysis of the 16S ribosomal RNA (16S rRNA) gene which is universally present in prokaryotes. In the analysis of field-scale anaerobic digesters using V3–V4 hypervariable region amplicons in 16S rRNA gene, the highly diverse prokaryotic microbiota of field anaerobic digesters in South Korea, along with the insignificant seasonal fluctuations in microbial composition and the significant difference from substrate type were found. In the comparison of MWS (municipal wastewater sludge)-treating digesters and the other non-MWS group that mainly treated food waste leachate, the MWS-treating digesters that have low biogas yield showed significantly high relative abundance of potentially counterproductive microbes (Hyphomicrobium and Methylotenera) for biogas production, while the non-MWS digesters with higher biogas yield showed significantly high relative abundance of versatile organic matter degraders (Fastidiosipila, DTU014, Acholeplasma, Lactobacillus, etc.). The predictive metabolic pathway analysis presented holistic insights on the importance of acetoclastic methanogenesis in all AD digesters, with carbohydrate and fatty acid metabolism showing high relative abundance in digesters with higher biogas yield.

For the analysis of human feces microbiota from term and preterm neonates, comparative analysis of 16S rRNA V3–V4 short-read data from Illumina platform and V1–V9 long-read data from Oxford Nanopore platform were shown to have noticeable differences in the relative abundance result of the samples, although both were statistically comparable with the Pearson correlation coefficient of r being higher than 0.9 among the samples subjected to both types of HTS for genus level analysis. The importance and utility of 16S rRNA gene full-region (V1–V9) sequencing was also demonstrated, as V3–V4 amplicons could not be bioinformatically assigned down to species-level, while V1–V9 amplicons showed acceptable level of the reads without significant increase in unassigned reads. The species-level analysis detected different species under a same genus for each of Enterococcus, Lactobacillus and Staphylococcus, and the presence of potentially pathogenic species of Klebsiella pneumoniae in the late preterm group that is heavily exposed to antibiotics use. The higher resolution of longer amplicon reads is also expected be beneficial in the analysis of other types of microbiomes, including the anaerobic digester microbiome.

This research showcases the importance of metataxonomic analysis on prokaryotic microbiota in different samples, and how the metataxonomic data can be bioinformatically utilized beyond relative abundance analysis of samples to seek out holistic trends and significances present in the complex composition of the prokaryotic microbiota in the samples, and how greatly the selection of target hypervariable regions in 16S rRNA gene hypervariable region from V1 to V9 affects the analysis result, especially in the taxonomic resolution of the data in genus and species level. This thesis is expected to provide comprehensive insights into the prospects and strategies for full-fledged utilization of the metataxonomic analysis and multi-meta-omics research to advance research on different types of microbiomes including anaerobic digester and human feces among many others.|지구의 여러 생물계는 세균 및 고균의 microbiota(미생물군), 즉 원핵생물군을 포함하고 있으며 이는 여러 복잡한 생물계에서의 중요한 구성 요소임이 밝혀지고 있다. 최근 몇 년간 HTS(high-throughput sequencing) 또는 NGS(next-generation sequencing) 기술의 기술 수준과 효율성이 지속적으로 발전함에 따라 이러한 마이크로바이옴(미생물군 유전체)에 존재하는 막대한 유전체 정보를 short-read(Illumina, Ion Torrent 등) 및 long-read(Oxford Nanopore 등) 서열분석기술을 활용하여 개별 실험실 규모로 조사할 수 있게 되었다. 그러나 매우 다양한 특성을 가진 수많은 종류의 미생물로 구성된 마이크로바이옴 분석의 본질적인 복잡성으로 인해 서열분석 데이터의 최적화된 생산 및 생명정보 분석에서의 객관적이고 범용적인 QC 및 표준화 등에는 추가적인 연구가 필요하다. 이러한 시각에서 먼저 서열분석 기술의 발전, 이로써 도래한 HTS(NGS) 기술이 다양한 환경 및 인간 마이크로바이옴 연구에 미치는 영향을 광범위한 문헌 조사를 통해 정리하였으며, 특히 혐기소화 기반 바이오하이탄(바이오가스 및 바이오수소) 생산 기술 고도화 측면에서는 다른 연관 분야와 융합적으로 활용될 수 있는 방향을 고찰하였다.

생물계에 존재하는 수많은 유형의 미생물 중 혐기성 소화조와 인간 장내 미생물군은 공통적으로 혐기성 조건에서 복잡한 유형의 유기물을 대사하는 매우 다양한 원핵 미생물군을 포함하며, 일반적으로 Firmicutes (Bacillota), Proteobacteria (Pseudomonadota), Bacteroidota, 및 Actinobacteria (Actinobacteriota) 등이 우점을 보인다. 본 논문에서는 바이오가스를 생성하는 현장 규모의 혐기성 소화조, 그리고 만삭아 및 조산아 대변에서의 미생물군에 보편적으로 존재하는 16S 리보솜 RNA(16S rRNA) 유전자의 메타택소노미 분석을 수행하였다. 16S rRNA 유전자의 V3-V4 hypervariable region amplicon 을 이용한 대한민국의 현장 규모 혐기소화조 분석에서는 공통적으로 매우 다양한 원핵생물군 조성이 확인되었고 계절적인 변동은 미미하였으나, 기질 유형에 의해서는 유의한 차이가 있는 점을 확인하였다. MWS(생활하수슬러지) 처리 소화조군과 음식물류폐기물 침출수를 주로 처리하는 non-MWS 소화조군을 비교한 결과, 바이오가스 수율이 낮게 보고된 MWS 처리 소화조군에서는 잠재적으로 수율 저하를 일으킬 가능성이 보고된 미생물(Hyphomicrobium 및 Methylotenera)이 상대적으로 풍부하게 나타났다. 이에 비해 바이오가스 수율이 더 높게 보고된 non-MWS 소화조군에서는 여러 다기능 분해균류(Fastidiosipila, DTU014, Acholeplasma, Lactobacillus 등)의 상대적 풍부도가 상당히 높았다. 추론적 대사경로 분석에서는 모든 혐기소화조에서의 아세트산 분해 메탄생성과정의 중요성에 대한 통찰 및 바이오가스 수율이 더 높은 non-MWS 소화조군에서 탄수화물 및 지방산 대사가 상대적으로 풍부하게 예측됨을 확인하였다.

만삭아와 조산아의 인간 분변 메타택소노미 분석에서는 Illumina 플랫폼의 16S rRNA V3–V4 short-read 데이터와 Oxford Nanopore 플랫폼의 V1–V9 long-read 데이터를 비교 분석하였으며 각 상대적 풍부도에서 눈에 띄는 차이가 있는 것으로 나타났으나, 두 유형의 HTS 분석을 모두 수행한 시료들의 속(genus) 수준 분석에서 Pearson 상관계수가 0.9 보다 높아 통계적으로 유사함을 확인하였다. 16S rRNA 유전자 V3–V4 영역 분석 결과에서는 생명정보학적으로 종(species) 수준까지 할당이 불가능하였으나, 전체영역(V1V9) 분석에서는 가능함을 보임으로써 그 중요성과 유용성을 입증하였다. 종 수준 분석에서는 Enterococcus, Lactobacillus, Staphylococcus 의 각 속에서 서로 다른 특정 종들이 다르게 나타났으며, 항생제 사용에 많이 노출된 후기 조산아 그룹에서는 잠재적으로 병원성을 지닐 수 있는 Klebsiella pneumoniae 종이 확인되었다. Long-read 데이터가 제공하는 고해상도의 종 수준 분석은 혐기소화 마이크로바이옴을 포함한 여러 다른 종류의 마이크로바이옴 분석에도 유용할 것으로 예상된다.

본 연구는 다양한 분석대상의 원핵생물군에 대한 메타택소노미 분석의 중요성과, 원핵생물군의 복잡성 내 존재하는 전체적인 경향 및 통찰을 확인하기 위해 상대우점도 분석에서 더 나아간 고도 생명정보학적 분석을 활용하였으며, 16S rRNA 유전자 내 V1V9 의 hypervariable 영역의 선택이 분류학적 분해능에 미치는 영향을 속 및 종 수준에서 확인하였다. 이는 혐기소화조 및 인간 분변 마이크로바이옴을 포함한 다양한 유형의 원핵생물군에서의 메타택소노미 분석 및 다중 메타오믹스 연구의 본격적인 활용을 위한 포괄적인 전략 및 전망에서의 통찰을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.