전사인자 조절로 배아체에서 조혈세포 형성 복합체로의 효과적인 분화

Abstract

The common methods to differentiate iPS cells to red blood cells (RBCs) have been to dissociate a hematopoietic induced embryoid body (EB) into a single cell during differentiation. However, this showed low enucleation rates of less than 30% and embryonic hemoglobin was mainly expressed. Recent reports that showed higher enucleation rates to 60% with fetal hemoglobin expression invented forming a structure called 'hematopoietic cell forming complex (HCFC)' which releases cells to supernatant from their stromal cells. We hypothesized that overexpressing hematopoietic transcription factors, TAL1 or HOXB4, via the formation of EB could enhance the formation of HCFC and the final differentiation to enucleated erythrocytes. . In this study, after EB formation, collected cells which were released during hematopoietic induction for 8 weeks were differentiated to RBC through 3 steps., During hematopoietic induction, HCFC known to have characteristics closer to hematopoietic than endothelial cell compare to other colonies which do not form HCFC by testing gene expression and cell marker. To observe the overexpression of transcription factors would enhance HCFC formation and RBC differentiation, TAL1 and HOXB4 were transduced to iPS cell by a Tet-inducible expression system. Overexpression of HOXB4 in iPSCs showed 1.5 times higher colony-forming rates. Overexpression of TAL1 showed 2 times higher HCFC formation rates and 1.2 times more cells were collected from HCFC during 1 week. HOXB4 overexpression did not show any difference. TAL1 overexpression consistently elevated mRNA expression of hemoglobin γ 10 times higher than hemoglobin ε, while control cells showed increased hemoglobin ε gene expression with wide variations. After terminal erythroid differentiation, controls showed 6-70% enucleation rates while TAL1 overexpression showed 15% and HOXB4 overexpression showed 25% of low enucleation rates. Transcription factor overexpression groups showed similar pattern to undifferentiated cells with differentiation and enucleation-associated genes at terminal differentiation. These results suggest that overexpression of transcription factors could assist differentiation to HCFC, but inhibits terminal differentiation, resulting in lower enucleation. Thus, further studies are needed on the mechanisms of transcription factors related to enucleation. |지금까지 유도만능줄기세포(iPS cell)로부터 적혈구로의 분화는 배아체(embryoid body, EB)를 적혈구계로 유도 후 단일 세포로 분해하여 분화시키는 방법이 주로 이용되었다. 그러나 이 배양법은 수혈용으로 개발하기에는 탈핵률이 30%미만으로 낮으며 배아형 헤모글로빈(hemoglobin epsilon, HBE)이 주로 발현되는 문제들이 있었다. 최근에 배아에서 조혈모세포로의 발생과정을 모방하여 적혈구계 세포로 유도시킬 때 ‘조혈세포 형성 복합체(HCFC)’라는 구조체를 형성하는 과정을 통해 탈핵률을 60%까지 높이고 태아 헤모글로빈을 발현시킨 보고가 있었다. 본 연구에서는 EB를 형성하는 방법을 기반으로 분화정도에 따른 세포의 유전자 및 cell marker 발현을 비교하고 TAL1과 HOXB4를 각각 hematopoietic induction, 유도만능줄기세포 단계 세포에 Tet-On 벡터를 이용해 과발현시켜 보다 효율적으로 HCFC를 형성하는 조건들을 개발하고, 적혈구로 분화가 증진되는지 보고자 하였다. 사람 iPS cell로부터 EB를 형성 후 8주간 조혈세포로 유도하는 동안 분화되어 상층액으로 나온 세포를 수거하여 3단계의 분화를 거쳐 적혈구로 분화시켰다. 이 때, HCFC를 형성한 colony는 조혈관련 전사인자들의 유전자 발현이 높고 CD34와 CD43이 동시에 발현되는 것을 보았을 때 그렇지 않는 colony보다 조혈세포에 가까우며 내피세포의 특성을 적게 보임을 알 수 있다. 이는 배아체를 조혈세포로 유도 시 혈원성 내피세포까지는 대부분 분화가 되지만 이중에서 일부만 HCFC로 분화되었음을 보여준다. 다음 연구에서는 유도만능줄기세포에 TAL1과 HOXB4 유전자를 Tet-on 벡터를 이용해 각각 형질 도입 후 GFP 발현을 이용해 유전자가 들어간 colony 만을 선별하여 배아체를 형성하였다. HOXB4를 과발현시킨 EB를 hematopoietic induction을 진행하여 대조군에 비해 1.5배 높은 EB 부착률을 나타냈다. 반면, TAL1을 과발현시에는 HCFC가 형성되는 비율이 대조군에 비해 2배 높은 것을 확인하였다. 또한 HCFC에서 상층액으로 나온 세포수가 TAL1을 과발현시킨 실험군에서 대조군에 비해 1.2배 많았다. 분화 중인 세포는 대조군이 HBE mRNA 발현정도에서 큰 편차를 보여주는 반면 TAL1을 과발현군에서는 HBE의 발현이 hemoglobin gamma(HBG)의 발현보다 1/10정도로 일관되게 낮음을 qRT-PCR로 확인하였다. 조혈세포 유도 시, HCFC에서 세포가 상층액으로 분화되어 나오는 것을 확인후 doxycycline을 제거하여 유전자 발현을 중지시켰다. 그 후 HCFC에서 분화되어 나온 세포를 수거하여 적혈구로의 분화를 완료하였다. 60-70% 정도 탈핵이 되는 대조군에 비해 TAL1을 과발현시킨 실험군에서는 15%, HOXB4를 과발현 시킨 실험군은 25%로 낮은 탈핵률을 보였다. 이는 상층액으로 분화되어 나오는 세포들에서는 Tet-off로 인해 과발현 유전자가 더 이상 발현하지 않음에도 불구하고, qRT-PCR로 분석 시 분화 및 탈핵에 관련된 유전자 발현 정도가 완전히 분화되지 않은 시기의 발현과 비슷한 양상을 보였다. 따라서, HCFC 유도 단계에서 TAL1의 과발현은 HCFC로의 분화에 도움이 되지만 이후 최종 분화시기까지 영향을 미쳐 탈핵을 저해한다는 것을 확인하였다. 따라서 탈핵과 관련된 TAL1과 HOXB4의 작용 기전에 대한 추가적인 연구가 필요할 것이다.