Development of computational design and analysis programs for genome editing

Abstract

CRISPR-Cas9 has been widely used in various research fields as an efficient genome editing tool. Various methods to analyze the mutation pattern of CRISPR-Cas9 and to analyze the sample in other research fields using CRISPR-Cas9 have been developed. In this thesis, we developed three experiment or analysis methods for CRISPR-Cas9; CReVIS-seq, CRISPR-Sub, and long-range PCR with Illumina. CReVIS-seq is a multiplexable analysis method using CRISPR-Cas9 to find integration sites for lentivirus, which is widely used to deliver DNA sequence into genomic DNA of cells. CRISPR-Sub is a statistical analysis method to detect the CRISPRinduced substitutions, which are hard to find in NGS data because of background errors from PCR and NGS. Long-range PCR with Illumina is an experiment and analysis method to measure the large deletions and small mutations using a highly accurate and short-read sequencer, Illumina.|크리스퍼 유전자 가위(CRISPR-Cas9)는 높은 효율과 간단한 실험 과정으로 주목받아 다양한 분야에서 이용되는 유전자 편집 도구이다. 크리스퍼 유전자 가위에 의한 DNA 염기 서열 돌연변이를 관측하거나 크리스퍼 유전자 가위를 이용하여 분석을 진행하는 여러 실험 및 분석 방법들이 개발되어 왔다. 본 연구에서는 새로이 개발한 크리스퍼 유전자 가위 실험과 관련된 세 가지 실험 방법(CReVIS-seq, CRISPR-Sub, long-range PCR with Illumina)을 소개하고자 한다. CReVIS-seq은 DNA를 전달하는 것에 널리 이용되는 lentivirus가 세포의 게놈에서 삽입되어 있는 위치를 CRISPR-Cas9을 이용하여 한 번에 여러 샘플에서 분석 가능한 방법이다. CRISPR-Sub는 기존에 PCR또는 NGS에 의해 생기는 치환 변이와 CRISPR-Cas9에 의해 생기는 치환 변이를 통계적인 방법을 이용하여 분석하는 방법이다. Long-range PCR with Illumina은 정확하지만 읽는 길이에 한계가 있는 Illumina 차세대 유전체 분석 장비를 이용하여 긴 결실과 짧은 돌연변이들을 한 번에 분석할 수 있는 방법이다. 본 연구에서 개발한 실험 방법이나 기존에 널리 일반적으로 이용되어 왔던 CRISPR-Cas9을 이용한 실험 방법은 프로그래밍을 이용한 분석을 필요로 한다. 그러나 크리스퍼 유전자 가위를 이용하는 모든 연구자들이 프로그래밍 지식을 습득하고 있지는 않다. 그래서 여러 크리스퍼 유전자 가위 관련 프로그램은 웹 브라우저에서 이용할 수 있도록 개발되어 왔다. 본 연구에서도 본 연구에서 개발한 세 가지 방법을 포함하여 총 7가지의 크리스퍼 유전자 가위 실험을 위한 웹 브라우저 기반 프로그램을 개발하였다. (i) BE-Designer와 (ii) BE-Analyzer는 염기 교정 유전자 가위(Base editor)의 목표 서열 디자인 및 차세대 유전체 분석 장비의 결과를 분석할 수 있는 웹 프로그램이다. (iii) PE-Designer와 (iv) PE-Analyzer는 프라임 교정 유전자 가위(Prime editor)의 pegRNA 서열 디자인 및 차세대 유전체 분석 장비의 결과를 분석할 수 있는 웹 프로그램이다. (v) CReVIS-seq web tool은 CRISPR-Cas9을 이용하여 lentivirus의 삽입 위치를 알 수 있는 실험 방법인 CReVIS-seq의 유전체 분석 결과를 분석할 수 있는 웹 프로그램이다. (vi) CRISPR-Sub web tool은 기존에 보편적으로 이용되는 방법인 deep sequencing의 유전체 분석 결과를 이용하여 크리스퍼 유전자 가위에 의한 치환 돌연변이를 통계적으로 찾아내는 웹 프로그램이다. (vii) Large-del은 긴 결실과 짧은 DNA 돌이를 한 번에 분석 가능한 long-range PCR with Illumina의 유전체 분석 결과를 분석할 수 있는 웹 프로그램이다. 이러한 웹 프로그램들은 Rgenome 웹 사이트에 누구나 무료로 이용할 수 있도록 공개하였다. 이러한 새로운 방법들과 웹 프로그램들이 크리스퍼 유전자 가위의 응용 범위를 넓히고 보편화 되는 것에 기여할 것이다.