Bioinformatic Approaches to Identify and Characterize Novel Enzymes in Bacterial Genomes and Metagenomes

Abstract

Microbial enzymes have an important role in biosynthetic pathways and chemical reactions within microorganisms. With the advances in next-generation sequencing (NGS) technology, the genomic information of microorganisms living in diverse environments such as humans, oceans, and soil has been directly sequenced without cultivation. As an increasing number of sequenced genomes and metagenomes, the identification and classification of enzymes need to explore comprehensively. In this dissertation, I aim to mine bacterial genomes and metagenomes for novel enzyme discovery and to demonstrate their taxonomic, sequence and structure characteristics. I developed a search algorithm and constructed profile hidden Markov models (pHMMs) to explore bacterial genomes and various microbiomes to identify and characterize microbial enzymes. Using this approach, ~300 putative sphingomyelinases C (SMases) and halogenases and > 3,000 putative true lipases were identified from bacterial genomes and metagenomes. Putative enzymes showed distinct taxonomic characteristics, sequence patterns, and structural conservation around the catalytic residues, substrate-binding and metal-binding sites. In the SMases study, newly identified SMases exhibited species-specific sequence patterns on edge metal-binding residues, unlike central metal-binding, and metagenomic SMases contain additional C-terminal regions of unknown biological function. Halogenase study revealed that key genomic determinants are responsible for regioselectivity of flavin-dependent tryptophan halogenases, tryptophan binding, and subsequent reactions. In the lipase study, a developed Bayesian classifier revealed the accurate classification of novel lipases into a specific subfamily. A comprehensive sequence and structural analyses provide a better explanation for the relatedness between subfamilies within family I and the relevance of previously characterized and newly discovered lipases. This study establishes the foundation for the discovery of novel enzymes from existing genomes and environmental metagenomes and sharpens our knowledge about their sequence and structural characteristics. |미생물 효소는 미생물 내 생합성 경로와 화학반응에 있어서 중요한 역할을 한다. 차세대 염기서열 분석 기술의 발달로 인간, 해양, 토양 등 다양한 환경에 서식하는 미생물의 유전체 정보는 배양없이 직접 시퀀싱 되고 있다. 시퀀싱된 유전체 및 메타유전체 수가 증가함에 따라 효소의 식별 및 분류는 포괄적으로 연구되어야 한다. 본 학위논문은 신규 효소 발굴을 위해 박테리아 유전체와 메타유전체를 마이닝하고 이들의 분류학적, 서열 및 구조적 특성을 규명하는 것을 목표로 한다. 신규 효소 발굴 및 분류를 위해 기존에 알려진 효소를 이용하여 상동성 조사 및 시퀀스 비교를 위한 검색 알고리즘을 개발하고 profile hidden Markov model을 구축하였다. 이를 통해 약 300개의 sphingomyelinase C (SMase) 및 halogenase 효소와 3000개 이상의 lipase효소를 박테리아 유전체 및 메타유전체로부터 발굴하였다. 동정한 신규 효소들은 촉매 잔기, 기질 결합 및 금속 결합 부위 잔기 등에서 뚜렷한 분류학적 특성, 서열 패턴 및 구조적 보존을 나타내는 것을 확인했다. SMase는 중앙 금속 결합 부위와 다르게 가장자리 금속 결합 잔기에서 종 특이적인 서열 패턴을 나타냈고 메타유전체로부터 발견된 효소에는 생물학적 기능이 알려지지 않은 추가 C-말단 영역이 포함되어 있음을 확인했다. Halogenase 연구는 flavin-dependent halogenase의 위치선택성 및 트립토판 결합에 관련한 주요 결정인자를 서열 및 구조적 관점에서 제시했다. Lipase 연구에서 개발된 Bayesian classifier는 새로운 lipase를 특정 subfamily로 정확하게 분류하는 것으로 나타났다. 또한 통합적인 서열 및 구조 분석을 통해 lipase family I 내 하위 분류 간의 관계 및 기존에 알려진 효소와 새로 발견한 lipase의 관계를 제시했다. 본 연구는 박테리아 유전체와 다양한 메타유전체에서 새로운 효소를 발견할 수 있는 기반을 마련하고 이들의 서열 및 구조적 특성에 대한 지식을 제공한다.