생체 바이오마커의 고감도 검출을 위한 나노자임 기반의 의료진단소재 개발

Abstract

나노자임 (Nanozyme)은 효소 유사 활성을 나타내는 나노물질로, 천연 효소에 대한 대체제로 여겨지고 있다. 나노자임은 천연 효소에 비해 정제 과정이 쉽고, 값싸게 화학적으로 대량 합성할 수 있으며, 주변 환경이나 반응 조건 (산도 및 온도) 및 보관 시간에 따라 활성이 잘 유지되는 안정성 등의 장점이 있다. 현재까지 다양한 종류의 천연 효소를 모방하는 나노자임이 개발되었고, 이에는 과산화효소 (peroxidase), 산화효소 (oxidase), 카탈라제 (catalase), 그리고 초과산화물 불균등화 효소 (superoxidase dismutase) 등이 있다. 다양한 효소를 모방할 수 있는 나노자임은 질병 진단, 환경 모니터링, 질병원인물질 혹은 환경유해물질의 제거 및 세포치료, 항산화-항노화-항염증 작용 등 다양한 분야에 활발히 응용되었고, 기존의 단백질 효소를 대체할 수 있는 새로운 인공효소 패러다임으로 각광을 받고 있다 본 연구에서, 우리는 나노 입자의 여러 조성을 기반으로 다양한 나노자임을 합성하였으며, 여러 생체 바이오마커를 검출하는데에 응용하였다. 먼저, 산화효소 유사 활성 (oxidase-like activity)을 나타내는 폴리 아크릴산 코팅 나노세리아(PNC)를 합성하였다. 산화효소 모방체로서, PNC는 과산화수소 (H2O2) 없이 3,3′,5,5′-테트라메틸벤지딘 (TMB)의 산화를 촉매할 수 있다. PNC는 중요한 카테콜아민 신경전달물질 중 하나인 노르에피네프린(norepinephrine, NE)의 측정에 적용되었다. PNC에 의해 산화된 TMB는 환원능력을 지닌 NE에 의해 다시 환원될 수 있다. NE에 의한 TMB의 산화환원 상태의 변화는 비색법과 전기화학적 방법으로 분석하였다. 제안된 검출 방법은 높은 감도로 양호한 선형 관계를 보여주었다. 다음 연구에서는 프러시안 블루 나노입자 (PBNP)를 제작했다. PBNP는 과산화수소 존재 하에 TMB의 산화를 촉매하는 과산화효소 유사 활성 (peroxidase-like activity)을 보였다. PBNP는 천연 효소 중 하나인 겨자무과산화효소 (horseradish peroxidase, HRP)보다 TMB와 H2O2에 대한 높은 친화력을 보였다. PBNP는 당뇨병의 중요한 지표 중 하나인 당화 알부민(glycated albumin, GA)을 검출하는 데 사용되었다. GA를 검출하기 위해, 우리는 GA의 시스-디올기 (cis-diol)에 대한 특정 수용체인 보론산 (boronic acid)을 사용하는 보론산 친화 샌드위치 분석법 (boronate affinity sandwich assay, BASA)을 개발했다. 샌드위치 분석법에는 보론산이 수식된 PBNP와 아가로스 비드 (agarose bead)가 사용되었다. GA 농도가 증가할수록 더 많은 샌드위치 복합체가 생성되고, PBNP에 의한 촉매 반응을 통해 더 많은 TMB가 산화된다. 샌드위치 복합체의 형성은 비색법과 전기화학적 방법으로 분석하였다. 두 방법 모두 GA 농도와 강력한 선형 관계를 보여주었다. 또한, 시트르산 (citric acid, CA)이 수식된 로듐-백금 나노입자(CA-RhPt NPs)를 간단한 습식화학법으로 합성하였다. CA-RhPt NPs는 우수한 과산화효소 유사 활성을 보였다. 또한, CA-RhPt NPs는 입자의 Rh 및 Pt의 시너지 효과로 인하여 단금속 Rh 및 Pt 나노 입자보다 과산화효소 유사 활성이 더 우수했다. CA-RhPt NPs의 촉매 메커니즘은 H2O2를 하이드록실 라디칼로 분해한 후 TMB를 산화시키는 것으로 나타났다. CA-RhPt NPs는 콜레스테롤의 비색 검출에 적용되었다. 콜레스테롤 산화효소를 포함한 효소-연쇄 반응을 통한 CA-RhPt NPs 기반 비색 분석은 상용화된 콜레스테롤 검출 키트에 버금가는 고감도 검출을 보였다. 다음 연구에서, 메조포러스 백금 나노입자(MPN)는 소프트 템플릿 매개 합성을 통해 제조되었다. 메조포러스 구조는 기공 유도제로 사용된 Pluronic F-127 기반의 마이셀 (micelle)을 제거하여 생성되었다. MPN은 메조포러스 구조의 존재로 인해 다른 백금계 나노자임 및 HRP보다 우수한 촉매 활성을 보였다. 또한 MPN의 촉매 기작이 HRP에서 관찰된 것처럼 탁구 메커니즘 (ping-pong mechanism)에 기반한다는 것을 밝혀냈다. 그런 다음 MPN은 효소 결합 면역 흡착 분석법(ELISA)을 통해 C 반응성 단백질(C-reactive protein, CRP)의 고감도 검출에 적용되었다. MPN 기반 ELISA는 HRP를 사용하는 기존 ELISA에 비해 동일한 CRP 농도 범위에서 더욱 감도 높은 검출을 보였다. 마지막으로 갈바닉 치환 반응 (galvanic replacement reaction)을 통해 중공 루테늄 나노입자(HRN)를 제작하였다. 중공 구조의 존재는 반응물의 전달을 촉진하고 표면적 대비 부피비를 증가시켜 촉매 활성을 향상시킬 수 있다. HRN은 뛰어난 과산화효소 유사 활성을 보였다. HRN의 촉매 메커니즘은 생성물이 방출되기 전에 두 개의 기질이 촉매에 결합하고 삼원 복합체 (ternary complex)를 형성하는 순차적 운동 기작 (sequential kinetic mechanism)에 기초하였다. 그런 다음 HRN은 기존의 ELISA 방식을 사용하여 CRP를 검출하는 데 활용되었다. HRN 기반 ELISA는 우수한 선형 관계와 검출 한계를 보여주며 CRP의 고감도 검출을 입증했다 |Nanozymes, referred to nanomaterials with intrinsic enzyme-like activities, have been considered as promising alternatives to natural enzymes. Compared to natural enzymes, the nanozymes possess numerous advantages such as ease of preparation, low cost, robustness in harsh environment, tunable activity, and excellent catalytic efficiency. To date, numerous nanozymes with different enzyme-mimicking properties including peroxidase, oxidase, catalase, and superoxide dismutase have been developed. These nanozymes were utilized to a wide range of applications in environmental treatment, antibacterial agents, disease diagnosis, therapy, and biosensing. In this thesis, we developed various nanozymes with different composition and applied the nanozymes to sensitive diagnosis of biomarkers. Firstly, we synthesized the poly acrylic acid-coated nanoceria (PNC) which shows the oxidase-like activity. As an oxidase mimic, the PNC could catalyze the oxidation of 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB) to blue colored product in the absence of hydrogen peroxide (H2O2). The PNC was applied to determination of norepinephrine (NE), which is one of the important catecholamine neurotransmitters. The oxidized TMB by the PNC can be reduced by NE due to the reducing ability of the NE. The change of redox state of TMB in the presence of NE was analyzed by colorimetric and electrochemical methods. The proposed detection methods showed a good linear relationship with high sensitivity. In next work, we fabricated Prussian blue nanoparticles (PBNPs) with intrinsic peroxidase-like activity, which catalyzed the oxidation of TMB in the presence of H2O2. The PBNPs showed higher affinity toward TMB and H2O2 than horseradish peroxidase (HRP), one of the natural enzymes. The PBNPs were utilized to detect the glycated albumin (GA), which is important indicator of diabetes mellitus. To detect the GA, we developed a novel boronate affinity sandwich assay (BASA) which use the boronic acid as a specific receptor for cis-diol group on the GA. For sandwich assay, boronic acid modified PBNPs and agarose beads were used. As the GA concentration increases, more sandwich complexes are generated, oxidizing more TMB through catalytic reaction by PBNPs. The formation of sandwich complexes was analyzed by colorimetric and electrochemical methods. Both methods showed a robust linear relationship with GA concentrations. Then, the citric acid modified rhodium-platinum nanoparticles (CA-RhPt NPs) were synthesized by a simple one-pot wet chemical method. The CA-RhPt NPs exhibited excellent peroxidase like activity. Furthermore, the peroxidase-like activity of CA-RhPt NPs were greater than monometallic Rh and Pt NPs due to the synergistic effects of Rh and Pt. The catalytic mechanism of the CA-RhPt NPs was found to decompose H2O2 to hydroxyl radical and then, oxidize the TMB. The CA-RhPt NPs were then applied to colorimetric detection of cholesterol. Based on the enzyme-cascade reaction combined with cholesterol oxidase, the CA-RhPt NPs-based colorimetric analysis showed sensitive cholesterol detection, comparable to commercialized cholesterol detection kit. In next work, mesoporous platinum nanoparticles (MPNs) were prepared by soft-template mediated synthesis. The mesoporous network was generated by removing the Pluronic F-127 micelles, which was used as pore-directing agents. The MPNs displayed excellent peroxidase-like activity, higher than other platinum based nanozymes and HRP due to the presence of mesoporous structure. The systematic study revealed that the catalytic mechanism of the MPNs was based on the ping-pong mechanism, as observed in HRP. The MPNs were then applied to sensitive detection of C-reactive protein (CRP) by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Compared to conventional ELISA which uses the HRP, the MPN-based ELISA showed more sensitive detection of CRP in the same concentration range. Finally, hollow ruthenium nanoparticles (HRNs) were fabricated by galvanic replacement reaction. The presence of hollow structure in HRNs can facilitate the transfer of reactants and increase the surface to volume ratio, resulting in the enhanced catalytic activity. The HRNs showed intrinsic peroxidase-like activity. The catalytic mechanism of the HRNs was based on the sequential kinetic mechanism in which two substrates bind to the catalyst and forms the ternary complex prior to release of the products. The HRNs were then utilized to detect the CRP using conventional ELISA. The HRN-based ELISA showed sensitive detection of CRP with excellent linear relationship and limit of detection.