Calcium ionophore-activated platelets induce eosinophil extracellular trap

Abstract

호산구는 과립구의 한 종류로써 세포 독성을 지닌 과립단백질을 가지며, 기생충 감염에 대한 숙주방어 및 알레르기성 염증 질환의 병리에 주요한 염증세포로 알려졌다. 호산구가 외부의 강한 자극에 반응하여 과립단백질이 침착 된 DNA를 세포 밖으로 방출하는 이른바 ‘호산구세포외덫’ 이라는 새로운 형태의 호산구 기능이 밝혀졌다. 호산구세포외덫은 천식을 포함한 여러 알레르기 질환의 염증부위에 존재하며, 침착 되어 있는 세포 독성을 가진 과립 단백질이 조직 손상을 일으킨다. 혈소판은 거핵세포로부터 유래한 핵이 없는 세포조각으로써 지혈 및 혈액응고 작용에 핵심적인 역할을 수행한다. 이러한 기능 이외에도 혈소판은 또한 면역반응을 유발하고 조절하는 면역세포로서의 기능도 점차 밝혀지고 있다. 혈소판은 300 종 이상의 단백질과 화학물질을 함유하고 있는 3가지 형태의 과립을 지니고 있으며, 활성화될 때 과립물질 뿐만 아니라 1µm 이만의 막구조-유래 소입자 (platelet derived microparticle, PMP)를 분비함으로써 혈소판의 기능을 수행한다. 혈소판은 알레르기 만성기도질환과 다수의 연관성이 있을 뿐만 아니라 특히 호중구를 자극하여 호중구세포외덫을 유발한다. 따라서 호산구와 혈소판이 알레르기 만성기도질환에서 중요한 역할을 고려할 때, 활성화된 혈소판이 호산구를 자극하여 호산구세포외덫을 유발할 수 있다는 가설을 세우고 이를 동정하는 연구를 수행하였다. 칼슘이온운반체인 A23187과 혈소판 활성화 물질인 thrombin 및 ADP로 혈소판을 자극한 후, conditioned medium (CM)과 pellet을 분획하고, 그 CM과 pellet으로 호산구를 자극하여 호산구세포외덫의 유도 여부를 측정하였다. 혈소판의 활성화 정도는 P-selectin/CD62P 발현 및 입자인 혈소판-유래 소입자 생성 정도를 유세포분석기로 측정하였다. P-selectin 발현과 PMP 생성은 A23187로 자극한 혈소판이 가장 높았고, thrombin 및 ADP로 자극한 혈소판 순서로 나타났다. A23817로 자극한 혈소판에서 유래한 CM과 pellet은 호산구세포외덫을 유도하였으나 thrombin이나 ADP으로 자극된 혈소판은 유도하지 못하였다. A23187-활성화 혈소판 유래 CM과 pellet은 사용된 혈소판 수에 비례하여 호산구세포외덫을 유도하였다. 또한, 활성화된 혈소판에 의해 유도된 호산구세포외덫은 NADPH oxidase의 활성에 비의존적이었는데, 이는 호산구를 A23187로 직접적으로 자극하여 생성된 호산구세포외덫이 NADPH oxidase의 활성에 의존적이라는 사실과 대조를 보였다. 이러한 결과는 A23187로 활성화된 혈소판에 의한 호산구세포외덫 유도는 잔여 A23817의 오염에 의한 것이 아님을 시사한다. A23187-활성화 혈소판 유래 CM과 pellet에 의한 호산구세포외덫 유도는 세포사멸의 한 형태인 necroptosis pathway의 저해제에 의해 억제되는 것으로 보아 활성화 혈소판에 의한 호산구세포외덫의 생성이 necroptosis pathway를 경유하여 발생하는 것으로 사료된다. PF-4는 활성화된 혈소판에서 가장 많이 분비되는 염증매개물질로서 호중구를 자극하여 호중구세포외덫을 유발하는 것으로 알려져 있는데, PF-4가 A23187-활성화 혈소판 유래 CM에 의해 유도된 호산구세포외덫과 완전히 일치하여 존재하다는 것을 관찰하였다. 그러나 pellet에서는 그러한 현상이 관찰되지 않았다. 이는 PF-4가 호중구세포외덫 뿐만 아니라 호산구세포외덫의 생성에 관여할 수 있다는 것과 활성화된 혈소판의 CM과 pellet에는 서로 다른 종류의 호산구세포외덫-유발 물질이 존재할 것으로 추론된다. 더 나아가 A23187로 자극한 혈소판 유래 CM과 pellet에서 36 종의 cytokines/chemokines을 Ab array를 통해서 조사하였다. 활성화되지 않은 혈소판과 비교할 때 활성화된 혈소판의 CM에서 IL-18과 SDF-1의 생성을 관찰하였고 pellet에서는 새롭게 생성된 cytokines/chemokines을 관찰할 수 없었다. 한편 비난치성 천식환자와 난치성 천식환자 사이에서 A23187-활성화 혈소판에 의한 호산구세포외덫의 발생 능력을 확인하였으나 두 집단 사이의 차이는 보이지 않았다. 요약하면 칼슘이온운반체인 A23187로 강력하게 활성화된 혈소판은 호산구세포외덫을 유도하였고, 이는 NADPH oxidase의 활성과 무관하며 necroptosis pathway를 경유한다. 활성화된 혈소판의 호산구세포외덫의 유도 능력은 혈소판이 알레르기 만성 기도질환의 병태생리를 조절하는 주된 방법일 수 있음을 제시한다. |Eosinophils, a subset of granulocytes, play a role in defense against parasitic infections and inflammatory allergic diseases. Activated eosinophils release eosinophil extracellular trap (EET), net-like DNA fibers decorated with cytotoxic granules and histones, that is implicated pathophysiology of allergic diseases such as asthma. Platelets are anucleated cell fragments generated from megakaryocytes that have essential role in hemostasis and thrombosis. Upon activation, platelets secret a vast array of granular contents and disintegrating into membrane-bound microparticles that modulate innate immune responses. In addition, activated platelets are known to elicit neutrophil extracellular trap (NET). Since an interplay between eosinophils and platelets is postulated to play a role in the pathogenesis of allergic airway inflammation. I investigated whether activated platelets were capable of inducing EET formation. To this end, platelets were activated by A23187 and platelet-specific agonists, thrombin and ADP, and fractionated to conditioned medium (CM) and pellet, which were then used to induce EET formation. Flow cytometry analysis demonstrated platelets were activated strongly by A23187, moderately by thrombin, and weakly by ADP, as judged by the combined effects on surface expression of P-selectin (also known as CD62P) and generation of microparticles. Both CM and pellet from the A23187-activated platelet cultures induced EET formation, whereas thrombin- or ADP-activated platelets failed to do so. The EET-triggering activities of both CM and pellet from the A23187-activated platelet cultures were linearly proportional to the number of activated platelets and were independent of NADPH oxidase, unlike EET formation that was induced by the direct stimulation of eosinophils with A23187, suggesting that the EET-triggering activity is highly unlikely derived from activated platelets rather than the residual A23187 in the platelet cultures. Both CM and pellet induced EET formation are inhibited by necroptosis inhibitors, indicating that activated platelet-induced EET formation requires necroptosis pathway. Interestingly, platelet factor-4 (PF-4), the most abundant component secreted by activated platelets, preferentially colocalized with EET that was induced by CM, but not pellet, from A23187-activated platelet cultures, suggesting that PF-4 could be an important trigger of EET formation, as it is shown to be able to elicit NET formation, and that CM and pellet from the activated platelet cultures may have different EET-driving factors. In agreement with the latter notion, cytokines/chemokines array analysis showed that IL-18 and SDF-1 was upregulated in CM, but not pellet, from A23187-activated platelet cultures. Finally, I found that capabilities of A23187-activated platelets to induce EET formation were comparable between patients with severe asthma and nonsevere asthma. In summary activated platelets and their products may induce EET formation in NADPH oxidase-independent and necroptosis pathway-dependent manners, potentiating their role in eosinophil-associated immunopathology by eliciting EET formation.