CRISPR/Cas9-based screening of deubiquitinases as a therapeutic target to suppress ROS-mediated prostate cancer tumorigenesis

Abstract

Prostate cancer (PCa) is the second leading cause of cancer-related deaths for males worldwide. Numerous factors and signaling pathways have been implicated in the development of Pca, but the exact etiology of PCa remains elusive. Aging and oxidative stress are some of the well established risk factors associated with the development of PCa. Oxidative stress is caused by excessive generation of reactive oxygen species (ROS) or a decrease in the free radical scavenging system. Higher levels of basal ROS in PCa cells result from mitochondria dysfunction, increased p66Shc, glucose metabolism (Warburg effect), and the activation of enzymes including NADPH oxidases, xanthine oxidases, and cytochrome P450. Activation of NADPH oxidase organizer 1 (NoxO1) is considered to majorly contribute to the ROS generation in the cell. Uncontrolled production of ROS through hyperactivation of NoxO1 disrupts cellular redox equilibrium and damage surrounding tissues, thereby contributing to a wide variety of diseases, including cancer. Hence, the expression of NoxO1 should be tightly regulated in order to maintain adequate pool of intracellular ROS. My study has elucidated the mechanism responsible for the post-translational modification of NoxO1 and its impact on ROS generation and cancer progression. Herein, I employed CRISPR-Cas9-based ubiquitin-specific proteases (USPs) knockout kit to systematically screen for deubiquitinating enzymes (DUBs) associated with NoxO1 protein expression and ROS production. I found that the deubiquitinase CYLD is a negative regulator of NoxO1 protein through the augmentation of NoxO1 ubiquitination and proteolysis. I also demonstrated that CYLD driven NoxO1 proteolytic pathway retards ROS generation which contributes to the suppression of carcinogenesis in vitro and in vivo. Overall, my study highlight a novel regulatory mechanism where CYLD recruitment to suppresses NoxO1-mediated oncogenic transformation thereby enabling comprehension of fine-tuned modulation of ROS signaling in PCa. ROS has also been shown to activate the androgen receptor (AR) signaling by regulating the AR-targeted transcription factors that plays a significant role to promote prostate tumor progression. Among genes that have been attributed to protect against oxidative stress in prostate is NKX3.1, a prostate-specific homeobox gene that regulates prostate differentiation and suppresses prostate cancer initiation. Decrease in NKX3.1 protein levels is a key initiating event in human PCa development. Hence, using our CRISPR-Cas9-based USPs knockout kit I identified USP49 positively regulate NKX3.1 protein by virtue of its deubiquitinating activity in prostate cancer cells. Consistently, USP49 overexpression stabilizes NKX3.1 protein further supporting its protective role against mitochondrial oxidative stress and suppression of tumor formation ability in vivo. Overall, my data suggest a synergistic, combinatorial approach of targeting ROS-mediated PCa progression by regulating the stability of key proteins, NoxO1 and NKX3.1 by the virtue of DUBs contributing to the development of effective cancer therapeutics. |국문 요지

전립선암 (Prostate cancer, PCa)은 전 세계 남성 암 관련 사망의 두 번째 주요 원인이다. PCa의 발병에는 수많은 요인과 신호 경로가 관련되어 있지만, PCa의 정확한 병인은 여전히 파악되지 않고 있다. 노화와 산화 스트레스는 PCa의 발병과 관련된 잘 확립된 위험 요인 중 하나이다. 산화적 스트레스는 활성 산소 종 (ROS)의 과도한 생성 또는 자유 라디칼 제거 시스템의 약화에 의해 발생한다. PCa 세포에서 염기성 ROS의 높은 수치는 미토콘드리아 기능 장애, p66Shc 증가, 포도당 대사 (워버그 효과), NADPH 산화효소, 잔틴 산화효소, 사이토크롬 P450을 포함한 효소의 활성화로 인해 발생한다. NADPH 산화효소 1 (NoxO1)의 활성화는 세포 내 ROS 생성에 크게 기여하는 것으로 알려져있다. NoxO1의 과활성화를 통한 ROS의 제어되지 않은 생성은 세포 산화환원 평형 상태를 방해하고 주변 조직을 손상시켜 암을 포함한 다양한 질병을 유발한다. 따라서, NoxO1의 발현은 세포 내 ROS의 적절한 양을 유지하기 위해 엄격하게 조절되어야 한다. 본 연구에서는 NoxO1의 번역 후 수정에 관여하는 메커니즘과 그것이 ROS 생성과 암 진행에 미치는 영향을 관찰하였다. NoxO1 단백질 발현 및 ROS 생성과 관련된 탈유비퀴틴 효소 (DUBs)를 체계적으로 선별하기 위해 CRISPR-Cas9 기반 유비퀴틴 특이 단백질 분해 효소 (USPs) 녹아웃 키트를 사용하였다. Dubiquitinase CYLD가 NoxO1의 편재화와 단백질 분해를 증가시킴으로써 NoxO1 단백질의 음성 조절제라는 것을 발견했다. 또한 CYLD 구동 NoxO1 단백질 분해 경로는 체외 및 체내 발암 억제에 기여하는 ROS 생성을 지연시킨다는 것을 입증하였다. 전반적으로, 본 연구는 CYLD 기능이 NoxO1 매개 종양 유발 변환을 억제하여 PCa에서 ROS 신호의 미세 조정을 한다는 새로운 규제 메커니즘을 제시하였다. 또한 ROS는 전립선 종양 진행을 촉진하는 중요한 역할을 하는 AR 표적 전사 인자를 조절함으로써 안드로겐 수용체 신호를 활성화하는 것으로 나타났다. 전립선의 산화 스트레스로부터 보호하는 것으로 알려진 유전자 중에는 전립선 분화를 조절하고 전립선 암 개시를 억제하는 전립선 특이 호메오박스 유전자인 NKX3.1이 있다. NKX3.1 단백질 수치의 감소는 인간 PCa 개발의 주요 유발 인자이다. 따라서 CRISPR-Cas9 기반 USPs 녹아웃 키트를 사용하여 USP49를 제거한 결과 USP49는 전립선 암 세포에서 NKX3.1 단백질을 탈유비퀴틴시켜 NKX3.1 단백질을 긍정적으로 조절한다고 확인하였다. 지속적인 USP49 과발현은 NKX3.1 단백질을 미토콘드리아 산화 스트레스 및 생체 내 종양 형성 능력 억제에 대한 보호 역할을 더욱 지지하여 안정화시킨다. 전반적으로, 본 연구 결과는 효과적인 암 치료제 개발에 기여하는 DUB의 핵심 단백질인 NoxO1과 NKX3.1의 안정성을 조절하여 ROS 매개 PCa 진행을 목표로 하는 시너지, 조합적 접근법을 제안한다.