Hydrogen Peroxide Sensitivity of Fur Family Proteins from Clostridioides difficile

Abstract

Clostridioides difficile is a gram-positive and anaerobic pathogen that is causing a rising number of infections worldwide. The infections can cause death and range from mild diarrhea to toxic megacolon. Due to the difficulty of culturing this bacterium and the special requirements for biosafety, the mechanisms that permit C. difficile to survive in the hostile host environment are still not well studied. Reactive Oxygen Species (ROS) are by-products of aerobic metabolism and include hydrogen peroxide (H2O2), superoxide anion (O2•-), and hydroxyl radical (HO•). These molecules can cause several damages in proteins, lipids, and nucleic acids, sometimes leading to cell death. To cope with the oxidative stress produced by ROS, bacteria developed efficient mechanisms, which include antioxidant enzymes and oxidative stress response sensor proteins that can induce appropriate defense systems. One of these sensors in most gram-positive bacteria is PerR. The prototype of these peroxide sensors is Bacillus subtilis PerR, which uses Fe2+-catalyzed histidine oxidation to sense lower levels of peroxide. In Clostridioides difficile, the mechanisms used for sensing hydrogen peroxide or activating defense mechanisms against ROS are still not well known. This bacterium has two proteins, CD630_08260 and CD630_12870, which are members of the Furfamily proteins and could act in the oxidative stress response. Comparison of the sequence of these proteins with PerR and Fur of B. subtilis and Staphylococcus aureus revealed that CD630_08260 is similar to PerR, and CD630_12870 is similar to Fur. Both proteins contain a structural metal-binding site with four cysteines residues which can coordinate Zn2+. In addition, CD630_08260 also has histidine residues motifs that are expected to be oxidized as occurs in B. subtilis. Here, I show that the peptides containing the histidine residues are oxidized in CD630_08260 expressed in E. coli under aerobic and anaerobic conditions, and that can sense low levels of H2O2 To investigate whether this protein uses Fe2+-catalyzed histidine oxidation like PerR of B. subtilis, I analyzed CD630_08260 and CD630_12870 by MALDI-TOF MS after the addition of FeCl2 or MnCl2. Protein CD630_08260 showed a mass increase of 16 Da at peptides containing the conserved histidine residues when FeCl2 was added and even without the treatment with H2O2, but did not show changes with the addition of MnCl2. In contrast, CD630_12870 did not show evidence of oxidation at the peptides containing the conserved histidine residues after the treatment with FeCl2 or MnCl2 and with the addition of hydrogen peroxide. Together, these data suggest that CD630_08260 could be considered a PerR-like protein that senses H2O2 and that CD630_12870 is probably a Fur-like protein implicated in the iron regulation in C. difficile, as was suggested in some studies. To investigate the activity repressor of CD630_08260 and CD630_12870, and whether they function as Fur-, PerR- or Zur-like proteins, I used B. subtilis mrgA, feuA, and yciC promoter-lacZ reporter fusion for β-galactosidase assay. CD630_12870 protein showed full repressor activity for feuA and yciC promoters, and the activity did not change after the treatment with H2O2 or with the addition of Fe2+ or Mn2+ when the assay was performed in minimal media. On the other side, CD630_08260 showed similar repressor activity to B. subtilis Fur protein when cells were grown in LB media. This protein showed a weak repression of feuA and yciC promoters when minimal media was used. Surprisingly, when Mn2+ was added to the media, CD630_08260 evidenced a strong repression activity of this protein to both promoters. However, in these assays, the addition of H2O2 did not produce significant changes in the repressor activity. Taken together these results, it can be suggested that the C. difficile proteins could act as a double repressor, having a still unknown mechanism of action. In summary, I propose that CD630_08260 could be considered as a PerR-like protein and CD630_12870 as a Fur protein, considering the possibility that both proteins may regulate genes under different conditions.

|Clostridioides difficile은 혐기성 환경에서 발견되는 그람 양성균으로 포자 및 독소를 생성하는 병원성 세균이다. 현재 전 세계적으로 이 세균의 감염이 증가하고 있으며 C. difficile의 감염 증상은 설사, 독성 결장 등에서 사망까지 다양하다. 이 세균은 배양이 어렵고 안전성에 문제가 있어 아직까지 숙주 환경에서의 생존에 대한 연구가 많이 진행되고 있지 않다. 활성 산소 종(ROS)은 호기성 대사의 부산물로 생성되며 과산화수소(H2O2), 슈퍼옥사이드 음이온(O2·-) 및 하이드록실 라디칼(HO·) 등이 있다. 이들은 다른 분자와의 반응성이 높기 때문에 단백질, 지질 및 핵산에 손상을 일으키고 때로는 세포사멸을 유발할 수 있다. 세균은 이러한 ROS에 의해 생성되는 산화 스트레스에 대처하기 위해 항산화 효소를 생성하고 산화 스트레스 감지 센서를 생산하는 등 효율적인 방법들을 개발했다. 현재 잘 알려진 ROS 센서 중 하나는 그람 양성 세균 Bacillus subtilis의 PerR이다. B. subtilis PerR은 과산화물 스트레스 감지에 철 이온을 이용한 히스티딘의 산화 기작를 사용한다고 알려져 있다. C. difficile에서 과산화수소를 감지하거나 ROS에 대한 방어 기작을 활성화하는 방법은 아직 많이 연구되지 않았다. 서열 비교분석을 통해 확인한 결과 이들은 산화스트레스에 반응하는 Fur-Family protein으로 추정되는 단백질을 2개(CD630_08260, CD630_12870) 가지고 있는 것으로 확인하였다. 두 단백질 서열을 B. subtilis와 Staphylococcus aureus의 Fur family와 비교한 결과 CD630_08260의 경우 PerR과, CD630_12870이 경우 Fur와 유사한 것이 확인되었다. 본 연구에서는 C. difficile이 가지는 두 단백질이 세포 내에서 어떠한 역할을 하는지 확인하고 기존에 알려진 그람 양성균인 B. subtilis, S. aureus와 비교하여 어떠한 차이가 있는지 확인하고자 하였다. 실험 결과 CD630_08260이 B. subtilis PerR처럼 히스티딘이 있는 peptide에서 철 이온이 있는 경우에만 산화가 일어난 것을 질량 분석을 통해 확인하였다. 그리고 산화된 경우 B. subtilis와 S. aureus의 PerR보다 더 낮은 농도의 H2O2에서 산화가 일어나는 것을 확인하였다. 또한 B. subtilis에서 각각 PerR, Fur, Zur regulon인 mgrA, feuA, 및 yciC 프로모터에 lacZ 리포터를 붙여 CD630_08260와 CD630_12870에 의해 조절되는지 실험한 결과 CD630_08260은 큰 변화를 확인하지 못하였으며 CD630_12870의 경우 Fur와 Zur regulon인 feuA와 yciC를 강하게 repression 하는 것을 확인하였다. 이러한 결과들을 통해 CD630_08260은 PerR의 역할을, CD630_12870의 경우 Fur또는 Zur의 역할을 할 것으로 추정하였으며 CD630_08260의 경우 다른 그람 양성균의 PerR에 비해 산화 스트레스에 sensitive한 것을 확인하였다. 요약하자면 C. difficile이 가지는 Fur family로 추정되는 두 단백질은 CD630_08260의 경우 PerR의 역할을, CD630_12870의 경우 Fur의 역할을 할 것으로 추정되며 CD630_08260의 경우 B. subtilis와 S. aureus의 PerR과 비교하였을 때 H2O2가 주는 과산화물 스트레스에 더 sensitive 한 것으로 보아 각 세균의 생존 환경에 따라 산화 스트레스 감지 능력에 차이가 있을 것으로 보인다. B. subtilis에서 진행된 fur family regulon의 조절 확인 실험을 통해 두 단백질의 역할을 추정하였지만 C. difficile이 가지는 Fur family 조절 인자와의 관계를 직접적으로 확인하지 못했다는 한계를 가진다. 본 연구는 감염성 세균인 C. difficile의 환경 스트레스 조절 기작을 밝히고 이들을 제어하는 방법을 찾는데 기여할 수 있음을 제시한다.