Intein-Mediated Protein Engineering for Intracellular Delivery and Biosensor Application

Abstract

단백질 공학은 단백질의 산업적 또는 의학적 활용을 위하여 단백질의 기능을 향상시키기 위해 사용되는 생명공학 기술로서 단백질 서열이나 구조를 변형하는 과정이다. 단백질 공학 기술 중에서 intein-mediated protein ligation (IPL)은 단백질 말단을 통한 단백질 고리화 (protein cyclization)와 단백질 변형 (protein modification)을 위해 널리 사용되고 있다. Intein은 대부분의 살아있는 생물체에서 찾을 수 있는 단백질 접합 효소이며 단백질과 단백질 또는 단백질과 펩티드, 그리고 단백질과 저분자 사이를 손쉽게 접합시킬 수 있다. 특히 다른 효소와 비교하여 intein은 상대적으로 작은 분자량과 빠른 반응속도 및 자가 스플라이싱 (self-splicing)의 장점을 가지고 있다. 본 연구에서는 intein을 매개로 한 단백질의 변형과정을 통해 세포 내 단백질 전달 및 바이오센서의 응용을 수행하였다. 첫번째 장에서는 IPL을 이용한 고리형 단백질 (cyclized protein)을 제작하여 단백질의 세포 내 전달 연구를 수행하였다. 단백질 모델로서 녹색 형광 단백질 (enhanced green fluorescent protein, EGFP)을 이용하여 EGFP에 세포 투과 펩타이드인 사량체 펩타이드인 R4 (tetra-arginine) 서열 혹은 세포막에 존재하는 인테그린 (integrin) 결합 삼량체 펩타이드인 RGD (arginylglycylaspartic acid) 서열을 각각 결합하여 발현된 단백질을 사용하였다. Nostoc punctiforme의 DNA polymerase III (DnaE)에서 유래된 intein (Npu DnaE intein)의 split형태를 이용하여 자가 스플라이싱 과정을 통해 고리형 단백질 (cycR4-EGFP 혹은 cycRGD-EGFP)을 제작하였으며 공초점 현미경 및 유세포 분석을 이용하여 확인한 결과 고리형 단백질이 비고리형 단백질 (R4-EGFP 혹은 RGD-EGFP)에 비해서 세포주 (HeLa, HT-1080, 및 HEK-293T)에서 세포 내 전달 효율 및 안정성이 크게 향상된 것을 확인하였다. 세포 내 전달은 사용한 펩타이드 서열에 따라 다른 이동 기작을 보여주었고, 본 연구를 활용하여 고리형 융합 단백질을 엑소좀 (exsome)에 다량으로 삽입한 이후에 엑소좀을 암세포에 처리할 경우 세포기질 (cytosol) 내로 효과적으로 전달할 수 있음을 확인하였다. 두번째 장에서는 IPL을 이용한 단백질과 펩토이드 (peptoide) 접합체를 제작하여 단백질의 미토콘드리아 표적 전달 연구를 수행하였다. 세포 내 단백질 가수분해 효과에 대응하기 위해 발광단백질 돌연변이체 (luciferase mutant)의 C 말단에 미토콘리아를 표적하는 것으로 알려지고 단백질 분해가 제한적인 펩토이드를 효과적으로 결합시켰다. 그 결과, 펩토이드-발광단백질의 결합체는 세포 배양액에 처리 시 세포 내 미토콘드리아에 효과적으로 전달되고 있음을 확인하였고, 이는 미토콘드리아막의 염색을 통해 증명하였다. 세번째 장에서는 IPL을 이용하여 발광 단백질 말단에 비오틴 (biotin)을 도입하였고, 이를 효소 활성 측정을 위한 바이오센서에 활용하였다. 세포 분비 단백질 분해효소 중 하나인 matrix metalloproteinase (MMP-7)의 활성을 측정하기 위해 발광단백질 C-말단기 앞에 MMP-7에 특이적인 펩타이드 기질을 삽입하고 C-말단을 비오틴화 (biotinylation)하여 아비딘 (avidin)이 코팅된 마이크로 웰 표면에 단백질을 고정하였다. 그 결과 MMP-7이 포함된 배지나 세포 조직 추출물에서는 발광단백질과 비오틴 사이가 절단된 이후 세척되어 마이크로 웰에서 발광신호가 크게 감소하였다. 상기 결과들을 토대로 본 연구에서 수행된 intein 기반의 단백질 설계방법은 단백질의 세포 내 전달과 바이오 센서로의 활용 가능성을 보여주었고, 다양한 단백질에 본 연구방법을 적용할 경우 질병진단 및 치료에 폭넓게 사용될 수 있을 것이다. |Protein engineering, a process or framework for modifying protein sequences or structures, has emerged as a key biotechnology to improve protein functions for industrial or medical applications. Among protein engineering techniques, intein-mediated protein ligation (IPL) has been central to terminal-specific protein cyclization and modification. Compared to other protein-modifying enzymes, IPL has many advantages including small molecular weight, fast reaction, split engineering, and self-cleavage. This thesis is divided into three chapters, focusing on the application of intein to intracellular protein delivery and protein-based biosensor. In the first chapter, an intracellular delivery strategy using IPL-based protein cyclization has been demonstrated. As a model protein, an enhanced green fluorescent protein (EGFP) was used by fusion with two types of peptides: a cell-penetrating peptide (tetra-arginine; R4) or an integrin-binding peptide (arginylglycylaspartic acid; RGD). A split Npu DnaE intein enabled the cyclization of the peptide-conjugated EGFP (pep-EGFP) via self-splicing process. Compared with linear proteins (R4-EGFP or RGD-EGFP), cyclized proteins (cycR4-EGFP or cycRGD-EGFP) exhibited enhanced intracellular efficiencies in the analyses of confocal imaging and fluorescence-activated cell sorting in HeLa, HT-1080 and HEK-293T cells. While the intracellular delivery mechanism was dependent on peptide sequences, pre-loading of cyclized fusion proteins into exosomes enabled cytosolic delivery into cancer cells without the need for endosomal escape. In the second chapter, IPL-based protein-peptoid conjugate was investigated for mitochondria-targeted protein delivery. EGFP was directly conjugated with a synthetic peptoid via IPL. A mitochondria-targeting peptoid was reported previously and chosen to accomplish mitochondria-targeted delivery of proteins in this study. Consequently, the intracellular delivery of peptoid-conjugated EGFP to cancer cell resulted in predominant localization in mitochondrial regions, which was confirmed using mitochondria-staining dye. This approach will be useful as a platform for organelle-targeted protein delivery. In the third chapter, I focused on the development of protein-based biosensor using IPL. To design a biosensor for the detection of matrix metalloproteinase (MMP) activity, intein-fused luciferase yielded the C-terminus-specific biotinylation of the luciferase in the presence of cysteine-biotin via intein-mediated splicing process. In presence of MMP, peptide linkage between luciferase and biotin was cleaved leading to the surface-induced bioluminescence signal was strongly reduced in MMP-secreted media or tissue extracts. Based on these results, it was revealed that intein-mediated protein cyclization and modification facilitated the development of effective protein delivery and biosensor. I suggest that this approach will be useful as a protein-based diagnostic and/or therapeutic platform.