Nontoxic Biomimetic Membrane Vesicle as a Gene Carrier for a Glioblastoma Gene Therapy

Abstract

교모세포종은 뇌종양 중에서도 특히나 사망률이 높고 치료가 어려운 악성 종양 중 하나이다. 세계보건기구(WHO)에서 가장 치명적이라고 분류하는 IV등급을 부여하였고 전세계적으로 많은 환자들이 고통받고 있다. 나이가 들수록 발병률이 높아지며 여성보다는 남성에게서 빈번하게 발생한다. 많은 치료법이 있지만 뇌 깊숙이 존재해 절제술로 완벽하게 제거가 불가능하고 약물치료로도 한계가 있기 때문에 쉽게 재발해 효과적인 치료법을 개발하는데 상당히 급선무로서 해결해야할 과제이다. 이에 따라 유전자치료법을 선택하였고 유전자의 전달체로서 Polyethylen-imine 25K(PEI25K)를 사용하기로 했다. PEI25K는 유전자 전달체로서 오랜 기간 동안 연구되어왔고 유전자와 정전기적 인력으로 쉽게 결합할 수 있는 장점이 있다. 반대로 생체독성이 있어 많은 양을 사용하기에는 적절하지 않다. 최근에는 세포막을 이용한 생체모방 나노운반체가 약물이나 치료유전자를 운반하는데 각광받고 있다. 이 연구에서는 PEI25/DNA 핵심물질을 C6 들쥐 뇌종양세포의 막으로 감싸서 치료효과를 보는 연구를 진행했다. 세포막으로 감싸진 나노 크기의 소낭은 PEI25K/DNA와 유사한 크기를 지녔으며 세포와 같이 표면에 음전하를 띄고 있다. C6 세포에 유전자 주입 후 발현량을 확인하여 in vitro 보다 in vivo 에서 좋은 효과를 낼 수 있다는 결과를 간접적으로 확인하였고, 사용한 세포막만으로 어느 정도의 동종인식능력이 있음을 확인했다. 더 나아가 MTT 실험을 통해 PEI25K와 달리 생체독성의 거의 없는 장점을 확인했다. 동물실험을 통해서 앞의 결과와 연관성있게 PEI25K 단독으로 치료유전자를 보낸 것 보다 생체독성은 더 없고 치료효과는 오히려 더 뛰어난 결과를 얻을 수 있었다. 이로 인해 세포막을 활용하는 것이 유전자전달체로서 유용한 운송수단이 될 수 있음을 보여준다.; Gene therapy with polymers has been introduced to malignant tumors as glioblastoma for alternative therapy for radio and chemical therapy. Polyethylenimine25K (PEI25K) has been utilized as a gene carrier for decades which can form a complex electrostatically. Recently, cell membranes are spotlighted for nano-carriers as biomimetic vesicles to deliver drugs and therapeutic genes. In this study, PEI25K/DNA complexes are encapsulated with extracted C6 rat glioblastoma cell membrane. With the membrane covered, it appears to form similar size as the PEI/DNA complex with low cytotoxicity. PEI25/DNA/Membrane complex is analyzed by measuring hydrodynamic size measurement, zeta potential, and transmission electron microscopy. Luciferase and MTT assay are performed to evaluate transfection efficiency, cytotoxicity and therapeutic effect. Moreover, PEI25K/DNA/Membrane complexes are formed from different cell type to figure out homologous attaching ability through transfection level by luciferase assay. TUNEL assay is performed to evaluate cytotoxicity in vitro and in vivo. Nissl staining and immunohistochemistry is performed to evaluate transfection efficiency of PEI25K/DNA/Membrane in vivo. As a result, PEI25K /DNA/Membrane can stably be stored for approximately twenty days compared to PEI25K /DNA complex. In addition, membrane vesicle shows almost no cytotoxicity and better therapeutic results in vivo. Overall results concluded that utilizing a cell membrane is suitable for DNA delivery with less cytotoxicity in vivo compared to usual polymer carrier.