Therapeutic effects of Toxoplasma gondii Dense granule protein 8 induced mitochondrial resuscitation in sepsis and cancer

Abstract

세포 내로 감염되는 기생충인 톡소포자충 (T. gondii)은 숙주 감염에서 중요한 역할을 하는 Granule dense proteins (GRAs)라는 독특한 단백질들을 가지고 있다. GRA 단백질들과 관련된 연구들은 T. gondii의 GRA8이 톡소플라즈마증에서 주목되는 혈청 진단 마커임을 설명하였지만, GRA8과 숙주 사이의 세포 네트워크에 관해서는 거의 알려져 있지 않다. 이 논문에서는 미토콘드리아에 대한 톡소포자충의 GRA8의 효과를 밝히고, 패혈증과 암에서 GRA8의 치료적인 효과에 대해 연구하였다. 첫번째 연구에서, GRA8과 상호작용하는 숙주 단백질을 발굴하고 이 단백질들과 GRA8의 상호작용에 의한 미토콘드리아 기능 활성이 패혈증의 치료전략으로 유용할 것이라는 것을 밝혔다. 면역침강법과 질량분석을 이용해 GRA8과 상호작용하는 미토콘드리아 단백질인 ATP5A1, SIRT3 그리고 ATP5C1을 발굴하였다. 미토콘드리아로 이동을 위해서 GRA8이 PKCα를 매개로 인산화가 되며 미토콘드리아에서 ATP5A1과 상호작용을 하는데 필요한 것을 보여줬다. GRA8의 미토콘드리아로 이동되면 GRA8이 ATP5A1과 SIRT3와 상호작용을 통해 미토콘드리아의 기능 및 신생성을 증가시켰다. 또한, SIRT3는 GRA8과 상호작용을 통해 ATP5A1의 탈아세틸화 (K506과 K531)를 증가시키며, ATP5A1의 활성 및 발현이 증가시켰다. 더불어, GRA8에 의한 미토콘드리아 기능 회복은 패혈증 동물 모델에서 놀라운 항혈증 효과를 보였다. 두번째 연구에서, GRA8의 결장암에서 항암효과를 확인하고, GRA8 유래 펩타이드를 제작하여 항결장암 치료 후보 물질로써 발굴하였다. SIRT3가 암에서 중요한 역할을 한다는 것을 참고하여, GRA8의 기능이 결장암에서 항암효과가 있는 것을 연구하였다. GRA8은 ATP5A1과 SIRT3와 상호작용을 통해 결장암세포를 사멸시키는 것을 보였다. GRA8에 유래된 항암효과 펩타이드를 제작하기 위해, GRA8의 미토콘드리아 이동과 ATP5A1/SIRT3와 상호작용하는 최소 영역을 밝혔으며, 암을 표적화하는 세포 침투 펩타이드인 ATRAM과 밝혀진 미토콘드리아 표적화 그리고 ATP5A1/SIRT3와 상호작용을 위한 필수의 최소 잔기를 포함하여 ATRAM-conjugated multifunctional GRA8 재조합 펩타이드 (rATRAM-G8-M/AS)를 개발하였다. 이 펩타이드는 HCT116 인간 암세포에서 GRA8과 비교하여 미토콘드리아 활성 및 생합성을 통한 암세포 사멸에 대해 상당히 개선된 효과를 보였으며, 세포에서 최대 200 배 더 낮고 동물 모델에서 500배 더 낮은 IC50 값에 도달하였다. 특히, rATRAM-G8-M/AS 투여는 미토콘드리아 대사 복구를 통해 마우스 이종 이식 모델에서 상당한 치료 효과를 보였으며, 생체 내에서 영향이 없는 면역원성 및 면역반응을 생성하였다. 종합하면, 이 연구들은 톡소포자충 GRA8을 매개한 미토콘드리아 기능 회복이 패혈증과 암에 대한 치료의 이해와 새로운 치료적 전략에 중요하다는 것을 보여준다.; The intracellular parasite Toxoplasma gondii (T. gondii) has unique dense granule proteins (GRAs) that are crucial for host infection. Emerging evidence suggests that GRA8 of T. gondii is a promising serodiagnostic marker in toxoplasmosis. However, understanding of interaction of GRA8 in host cellular signaling is unknown. In this dissertation, I demonstrated the role of T. gondii protein GRA8 in the host mitochondria and investigated therapeutic effects against sepsis and cancer. In the first study, I found interaction of GRA8 with host proteins involved in mitochondria activation and biogenesis and might be useful as a therapeutic strategy for sepsis. Through co-immunoprecipitation and mass spectrometry, I found partners of GRA8 that is localized into mitochondria, such as SIRT3, ATP5A1 and ATP5C1. For trafficking to mitochondria, GRA8 showed that protein kinase Cα (PKCα)-mediated phosphorylation of T. gondii GRA8 (Thr220) is required and regulates the interaction of C terminal of GRA8 with nucleotide binding domain of ATP5A1. After trafficking to mitochondria, GRA8 increased mitochondrial activity and biogenesis via interaction with binding partner. Furthermore, interaction of GRA8 with SIRT3 in mitochondria facilitates ATP5A1 deacetylation (K506 and K531) by increasing expression of ATP5A1. Remarkably mitochondrial resuscitation by GRA8 have an effect on anti-septic activity in vivo. In second study, I showed anti-tumor effect of GRA8 through recovering the mitochondria. Furthermore, I constructed a recombinant acidity-triggered rational membrane (ATRAM)-conjugated multifunctional GRA8 peptide (rATRAM-G8-M/AS) comprising ATRAM peptide for targeting and penetrating the cancer cell, and essential/minimal residues for mitochondrial targeting or ATP5A1/SIRT3 binding. This peptide showed significantly improved potency about cancer cell death via increasing mitochondrial activity and biogenesis compared with rGRA8 alone in HCT116 human carcinoma cells, reaching an IC50 value of up to 200-fold lower in vitro and 500-fold lower in vivo. Notably, rATRAM-G8-M/AS treatment showed significantly therapeutic effects in a mouse xenograft model through mitochondrial metabolic resuscitation, and it produced negligible immunogenicity and immune responses in vivo. Taken together, improved mitochondrial function-induced T. gondii GRA8 demonstrated mitochondrial resuscitation is essential for new therapeutic strategy against sepsis and cancer.