신물질 CR2-R389의 PA-1 난소암 세포주에서의 세포주기 조절 및 세포 사멸 유도 효과

Abstract

현재 사용되고 있는 대부분의 항암제는 궁극적으로 세포의 DNA에 직접적인 손상을 주거나 혹은 암세포의 성장 시 DNA의 정상적 형성에 이상을 초래함으로써 암세포의 사멸을 유도하는 기전이다. 그러나 이러한 기전을 바탕으로 개발된 항암제는 빠른 시간 내에 내성을 유발한다는 심각한 문제점을 가지고 있었다. 따라서 최근에는 세계적으로 기존의 항암제에서 나타난 여러 가지 부작용과 내성의 문제점을 보완하여 암세포의 직접적인 DNA 합성을 억제하는 기전이 아닌 암세포의 세포주기 조절 억제와 세포 사멸 유도를 통해 암세포를 괴사시킬 수 있는 새로운 항암 물질을 찾는데 초점이 맞춰지고 있다. 따라서 본 연구에서는 기존의 항암 활성이 보고된 천연물질을 이용한 신 물질 유도체 합성 기술이 아닌 최신 분자설계기술을 통하여 특정 CDK를 표적으로 억제할 수 있는 물질을 도출하고 이의 작용기전을 알아보고자 하였다. 앞선 연구에서 최신 분자설계기술을 통하여 특정 CDK2를 표면적으로 억제 할 수 있는 CR2-R29로 명명한 새로운 물질을 도출하였으며, 이 물질을 통해 세포주기 조절 억제를 통한 암 세포의 사멸을 유도할 수 있었다. 하지만, CR2-R29의 경우에, 처음 기대하였던 CDK2 active site의 essential residue들과 강한 결합을 할 수 있는 구조에는 조금 미진한 부분이 발견되었다. 따라서 본 연구에서는 R-29를 모체로 새로운 골격구조를 갖는 새로운 유도체들을 합성하였으며, 암세포에 선택적인 항암 활성을 보인 CR2-R389로 명명한 새로운 유도체를 발굴함으로써 인체 난소암세포에서의 CR2-R389의 항암 작용기전을 연구하였다. CR2-R389의 항암 활성 기전을 알아보기 위해 다양한 난소암세포에서의 세포성장 억제 활성을 살펴본 결과 여러가지 정상 세포 주에서는 세포성장 억제활성을 보이지 않는 반면, 난소 암 세포 주들 중에서도 특이적으로 PA-1에서 우수한 활성이 확인되었다. 좀 더 정밀한 수준의 항암 활성 기전을 규명하기 위해 다양한 항암 활성 작용기전을 다양한 세포생물학적 방법을 통하여 알아보았다. PA-1 세포 주에 농도 40 μM의 CR2-R389를 synchronization후 시간 별로(0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 20, 24)처리한 결과, G2/M phase에서 세포주기 억제와 더불어 세포 사멸이 유도됨을 확인하였다. 또한 단백질과 mRNA level에서의 발현을 통하여 세포주기 주요 조절 인자들의 변화 양상을 확인함으로써, 세포주기 억제가 유도되는 것임을 확인하였다. CR2-R389에 의해 발생된 세포 사멸 기전은 미토콘드리아로부터 방출된 Cytochrome c에 의한 caspase들의 연속적인 활성화(caspase cascade)를 통해 유도됨을 확인하였다. 결론적으로, 신 물질 CR2-R389는 난소 암세포 주 중에서도 PA-1 세포 주에서 선택적인 항암 활성을 가지고 있는 것을 확인하였다. 즉, CR2-R389가 세포주기와 세포 사멸 조절에 관여하는 주요 인자들을 조절함으로써, 세포주기 억제와 세포 사멸을 다양한 기전으로 유도한다는 것을 확인하였다. 이와 같이, 본 연구에서는 CR2-R389가 난소 암에서 새로운 개념의 항암제로서의 가능성을 제시해 보았다.; Most of conventional anti-cancer drugs were induced direct inhibition of DNA synthesis in cancer cells. And they have a serious side effect like as tolerance or non-specific inhibition in normal cell. As the reason, we try to find out the anti-cancer drug candidate to overcome the side effect of existing anti-cancer drug using technology of structure-based drug design. CR2-R389 was a inhibitor of CDKs found by structure-based drug design technology. To determine the mechanism behind the antitumor activity of CR2- R389, the effects of CR2-R389 on the viability and cell cycle progression were investigated in human ovarian cancer PA-1 cells. CR2-R389 showed a growth inhibition activities in PA-1 (GI50: 40 μM) and no toxicity in normal cells in MTT assay. A flow cytometric analysis using propidium iodide(PI) revealed that CR2-R389 induced the cell cycle arrest at the G2/M phase tested so far. Western blot analysis demonstrated that CR2-R389 induced cell cycle arrest through accumulation of cyclin B after treatment with 40 μM CR2-R389. So, CR2-R389 induced deregulation of cyclin degradation, precipitating cell cycle arrest and apoptosis. And the kinetic assay revealed that CR2-R389 decreased the activity of CDK1 CDK2 and Cyclin B. Moreover, a flow cytometric analysis using FITC-dUTP and propidium iodide(PI) showed that the apoptotic cell population increased in timedependent manner. Nuclear DAPI staining revealed that cell lines showed that typical nuclear features of apoptosis after treatment with 40 μM CR2- R389. This apoptotic induction was associated with the activation of Bax by p53 and a release of cytochrome c from mitochondria into the cytosol, followed by the activation of caspase 3 and inactivation of PARP. In conclusion, CR2-R389 induced cell cycle arrest and apoptosis in PA-1 human ovarian cancer cells, but no effect in normal cells. Thus, we suggested that CR2-R389 has a potential to serve as a novel anticancer drug.