Functional analyses of mouse lymphocyte activation gene-3

Abstract

LAG-3는 CD4와 구조적으로 매우 유사하고, 주요조직 적합성 항원 Ⅱ (MHC class Ⅱ)에 결합하여 T 림프구 특이적 co-receptor라 여겨진다. 또한, LAG-3는 주로 활성화 된 T 림프구에서만 발현하며 CD4와 비교하였을 때 MHC class II와의 친화도가 100배 이상 높은 특징을 가지고 있다. 그러나, 지금까지는 활성화 된 T 림프구와 LAG-3간의 상관관계에 대한 자세한 기전에 대한 연구가 진행 된바 없다. 따라서 본 연구의 목적은 T 림프구에서 LAG-3의 발현과 기능의 연관성, 또한 LAG-3에 의해 전달되는 신호 경로에 대한 탐구에 있다. 우선 LAG-3의 발현여부가 알려진 바가 없는, CD1d에 제한적인 NKT cell을 활성화 한 후 LAG-3의 발현을 확인하였고 이러한 LAG-3의 과발현에 의해 활성화 된 NKT cell에서 S-phase cell cycle arrest가 일어남을 알 수 있었다. 또한, LAG-3를 T 림프구 특이적으로 과발현하는 형질전환생쥐를 제작하여, LAG-3 과발현 생쥐 유래 T 림프구의 표현형을 분석하고 항원 특이적 면역 반응성을 살펴 보았다. 그 결과, LAG-3 과발현 생쥐는 대조군에 비해 비장에서 T 림프구의 숫자가 감소하는 것을 관찰 할 수 있었으며, 특정항원에 특이적인 세포증식과 superantigen (staphylococcus enterotoxin B)에 의한 AICD (activation induced cell death)의 감소를 확인 할 수 있었다. 이러한 T림프구의 세포 증식 능력 변화에 관여하는 LAG-3의 신호전달체계를 연구하기 위해, LAP (LAG-3 associated protein)과 상호작용하는 단백질을 yeast two-hybrid 방법을 사용하여 탐색하였다. 그 결과 LAP이 ubiquitine ligase complex의 한 구성요소인 p19A (Skp1)와 핵 내에서 상호 작용하는 것을 알아냈다. 또한, 이러한 Skp1과 LAP의 상호작용으로 p27의 ubiquitination에 의한 degradation이 감소되는 것을 확인하였다. 따라서 LAG-3에 의한 세포 내 신호전달은 p27의 핵 내 안정성을 높여, cyclin A 와 CDK2에 의한 S-phase progression을 억제하는 것으로 생각된다. 결론적으로 본 연구에서 밝혀진 LAG-3의 기능은 활성화 된 T 림프구에서 선택적으로 발현됨으로써, 활성화 된 T 림프구의 S phase 진입을 억제하고, 그 결과 세포활성화에 동반하여 나타나는 AICD (activation induced cell death)를 억제하는 주요 기전으로 생각된다. 이러한 LAG-3의 기능은 결국 T 림프구의 항상성(homeostasis) 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 추론된다.; The lymphocyte activation gene-3 (LAG-3) is a CD4-related, activation-induced cell surface molecules that binds to MHC class II with 100-fold higher affinity than of CD4. But, the function of LAG-3 has not been fully understood. Here, we have investigated the functional and expression analysis of LAG-3 in T lymphocyte and signal transduction pathways of LAG-3. First, we found murine LAG-3 is inducible on CD1d-restricted NKT cells as the result of a variety of stimulation. Also, ectopic LAG-3 expression on CD1d-restricted NKT cells resulted in a cell cycle arrest in the S phase. These results show that LAG-3 signaling on activated CD1d-restricted NKT cells may down-modulate NKT cell proliferation. Second, we confirmed the phenotype analysis in LAG-3 overexpressed transgenic mice. In result, we could assure that the overexpression of LAG-3 suppress T lymphocyte in thymus and spleen. Also, T cells from LAG-3 transgenic mice showed the decreased the proliferation rate to specific antigens and less sensitive to activation induced cell death (AICD) mediated by Staphylococcus Enterotoxin B (SEB). Third, we identified LAP bind to the p19A (Skp1) by yeast two-hybrid system and then showed that the effects of p19A and LAP. We conformed that the interaction of p19A and LAP brings about degradation by ubiquitination of p27. Therefore, we guess that restraints S-phase progression by cyclin A and CDK2 through LAG-3 signal transmission helps inside of p27 stabilized. In conclusion of this research, LAG-3 is main molecules to be appeared selectively and controlled cell cycle for activated T cell to suppress activation induced cell death (AICD). It can be inferred that this LAG-3 has a significant role for maintaining homeostasis of T cell through our experiments.