전립샘 암세포에서 Doxazosin에 의해 유도되는 세포자연사와 Clusterin의 발현 변화에 관한 연구

Abstract

전립샘 암은 안드로젠 의존성에서 비의존성으로 성장하여 진행되면서 림프절과 골수로 전이되어 결국 사망을 초래하게 된다. 전립샘 암의 치료는 수술적 방법, 방사선 요법, 호르몬 요법 등이 쓰이고 있으나 이러한 방법은 안드로젠에 비의존적으로 성장하는 암을 치료하기에 한계가 있으며, 따라서 전립샘 암을 치료하기 위하여 보다 효과적인 치료법이나 약제 등에 대한 연구가 필요한 실정이다. 최근 전립샘 암을 치료하는 방법으로 quinazoline 계의 화합물인 아드레날린성 수용체 길항제 (α1-adrenoceptor antagonist)는 안드로젠에 비의존적으로 자라는 암에서 세포자연사를 일으켜 암세포의 성장을 막는다고 보고된 바 있으며, 대표적인 약제로 doxazosin, terazosin은 전립샘 암의 내피세포 (endothelial cell)의 침습과 체내 이동을 억제하여 세포자연사를 유발시킨다 (Keledjian et al., 2005). Clusterin은 당단백질로써 남성의 전립샘 조직으로부터 처음으로 분리되었으나, 현재는 전립샘 이외에도 포유류의 다양한 조직이나 체액에 분포하는 것으로 알려지고 있다. Clusterin은 질병이나 자극이 있을 때 세포에서 과발현되는데, 현재 세포자연사 억제 인자로써의 작용에 대해 연구되고 있다. 그러나 전립샘 암의 진행에서 세포자연사가 유도되었을 때 발현되는 clusterin 단백질의 역할에 관한 연구는 명확히 이루어지지 않은 상태이다. 그러므로 본 연구는 전립샘 암세포에서 아드레날린성 수용체 길항제인 doxazosin에 의해 유도되는 세포자연사와 이에 따른 clusterin 단백질 발현과의 연관성을 규명하고자 하였다. 제 1장에서는 사람 전립샘 암 조직에서 악성 정도에 따른 세포자연사의 차이와 clusterin 발현 정도의 차이를 조사하였다. Gleason 등급에 따른 각각의 전립샘 암 조직에서 분화도가 나빠질수록 clusterin의 발현 정도가 증가하는 반면 세포자연사의 비율은 유의하게 감소하였다. 또한 면역조직화학 염색을 시행한 결과, 세포자연사가 일어나지 않은 세포에서는 clusterin이 발현되었고, clusterin의 발현이 없는 세포에서는 세포자연사가 일어나는 것을 확인하였다. 악성도가 각기 다른 전립샘 암 세포주에 doxazosin을 처리하여 세포자연사를 유도한 결과, 악성 정도에 따라 clusterin의 발현은 현저히 증가하였다. Clusterin이 악성도가 심한 전립샘 암에서 현저히 발현되는 것을 미루어 볼 때, clusterin의 발현은 세포자연사 억제 인자로 작용하여 암의 진행에 도움을 주는 것으로 사료된다. 제 2장에서는 전립샘 암 세포주 (PC-3)에서 doxazosin에 의한 세포자연사와 clusterin 발현 관계를 알아보고, clusterin의 발현 억제에 따른 doxazosin에 대한 저항성과 세포자연사의 변화를 알아보고자 하였다. 전립샘 암 세포주 (PC-3)에 doxazosin을 24, 48, 72 시간 동안 처리한 결과, clusterin mRNA 발현은 처리 후 9 시간부터 48 시간까지 유의성 있게 증가하였다. 그러나 clusterin 단백질의 발현은 24 시간 이후부터 증가하기 시작하였고, 동시에 세포자연사도 함께 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 근거로 하여, 전립샘 암세포는 세포자연사가 일어나기 전, 세포자연사 억제 단백질인 clusterin을 세포질 내에 증가시킴으로써 세포사멸을 억제한다는 가설을 세웠다. 이 가설을 증명하기 위해 small interfering RNA (siRNA) 방법으로 암세포에서 clusterin의 특이적 발현을 억제시킨 후 doxazosin을 처리한 결과, siRNA를 시행한 암세포에서 세포자연사는 siRNA를 시행하지 않은 암세포에 비해 세포자연사가 현저히 증가하였다. 이는 clusterin이 항세포자연사 단백질로써 세포자연사를 지연 또는 억제시킬 수 있음을 보여준다. 제 3장에서는 전립샘 암 세포주인 LNCaP에서 계대배양을 통해 호르몬에 내성이 있는 세포를 구축한 후, doxazosin에 의한 세포자연사와 clusterin의 변화의 차이를 확인하고 각 세포의 단백질 발현 차이를 비교·분석함으로써 호르몬의 의존도에 따른 세포의 분자적 차이를 알아보고자 하였다. 각각의 세포에서 호르몬 의존도에 따른 세포의 성장률은 후기 계대배양 세포에서 40% 정도 높게 나타났다. 또한 구축된 세포에 doxazosin을 처리 한 결과, 초기 계대배양 세포와 비교할 때 후기 계대배양 세포에서 세포자연사의 비율이 보다 적게 나타났다. 반면, clusterin 발현은 후기 계대배양 세포에서 유의성있게 증가하였다. 세포 내 단백질 발현 변화를 이차원 전기영동 (2-DE)으로 분석한 결과, 등전점 (pI)에 따라 10 개 이상의 단백질의 발현이 현저하게 증감되는 것을 알 수 있었고, 안드로젠 수용체의 양이 증가하는 것을 확인하였다. 안드로젠 수용체의 발현이 억제되었을 때 세포의 단백질 발현이 현저하게 변화되는 것으로 보아 호르몬 비의존성 세포로 분화하는 동안의 분자적 변화를 이해하는데 중요한 역할을 할 것으로 사료된다. 결론적으로, 아드레날린성 수용체 길항제인 doxazosin은 전립샘 암세포에서 세포자연사를 증가시키고 동시에 clusterin의 발현을 증가시킴으로써, clusterin이 doxazosin에 의한 세포자연사 초기 과정의 사멸신호로부터 자신을 보호하는 방어 단백질의 기능을 하는 것으로 생각된다. 본 연구는 세포자연사 관련 인자의 유전자 조작이나 단백질 발현 억제는 전립샘 암 치료에 기초가 될 것으로 사료된다.; Prostate cancer continues to afflict many thousands of American males and is the cause of approximately 30,000 deaths per year. Prostate cancer mortality results from metastases to the bone and lymph nodes together with progression from androgen-dependent to androgen-independent disease. In recent years, though new therapies and medicines for treating metastatic prostate cancer have been developed, yet no successful treatment is available to ensure survival of these cancer patients. Quinazoline-based α1-blockers, such as doxazosin and terazosin, have shown anti-tumor efficacy by induction of apoptosis in prostate cancer cells though α1-adrenoceptor-independent mechanisms. It has been reported that doxazosin and terazosin suppress the invasion and migration of prostate cancer and endothelial cells, to reduce adhesion potential with extracellular matrix components, and to induce apoptosis in prostate cancer cells. Clusterin is a glycoprotein that was initially isolated from the male reproductive system, prostate. Subsequently, clusterin has been found to be widely distributed in a variety of tissue and body fluids in mammals. Clusterin is known as anti-apoptotic factor induced as the results of cellular injury, death, or pathology. However, the roles of clusterin on apoptosis in prostate cancer cells are not yet completely clarified. In the present studies, therefore, have performed to investigate whether clusterin could play an important role in the protection of prostate cancer cells from doxazosin-induced apoptosis. In Chapter 1, the relevancy between the apoptotic index in prostate cancer tissue and clusterin expression according to Gleason grade was investigated. Clusterin expression was increased depending on Gleason grade, whereas apoptotic index was decreased. By immunofluorescence staining, apoptosis was not detected in the cells showing the expression of clusterin. In human prostate cells after doxazosin treatment in vitro, clusterin expression was significantly increased before apoptosis occurred in the cells. These findings suggest that over-expression of clusterin in the cells prior to apoptosis may be critical to regulate the cell death in prostate cancer cells. In Chapter 2, the relationships between the apoptosis induced by doxazosin and clusterin expression in a human prostate cancer cell line (PC-3) and the specific inhibitory effects of clusterin gene on apoptosis induced by doxazosin were evaluated. PC-3 cells were cultured and treated with doxazosin for 9, 24, 48, and 72 h. Clusterin mRNA expression was significantly increased 9 h after the treatment and remained high levels until 48 h, whereas the protein expression as well as apoptosis started being increased at 24 h. From these results, it was hypothesized that the increase of clusterin expression in the cells before undergoing apoptosis could inhibit the cell death of cancer cells. To prove this, the apoptosis in PC-3 cells induced by doxazosin after blocking of the clusterin protein production in the cells using clusterin specific siRNA oligonucleotides was investigated. The number of apoptotic cells was significantly increased in clusterin siRNA cells compared to control siRNA. These results suggest that clusterin protein might effectively block or delay the cell death of cancer cells. In Chapter 3, androgen-independent LNCaP cell lines were established from a human prostate cancer cell line (LNCaP) though the prolonged culture method. It was accessed the difference of proteins in the cell according to hormone dependency using androgen independent LNCaP cell lines. The last passage of LNCaP cells exhibited an aggressive growth rate of 40% compared to the hormone-dependent early passage cells. Furthermore, apoptotic rate was reduced after doxazosin treatment more in the late passage LNCaP cells than in the early LNCaP cells, but clusterin expression was increased more in the late passage than in the early passage. In the analysis of proteins by two-dimensional electrophoresis, over 10 proteins were expressed significantly high in androgen independent cells and androgen receptor protein was also increased. These changes of the expression of the proteins and androgen receptors might be applied the understanding of molecular mechanism involved in the development of androgen independent prostate cancer. Taken together, the present studies demonstrate that doxazosin, α1-adrenoceptor antagonist increases clusterin expression before apoptosis occurs in human prostate cancer cells. These results suggest that clusterin might be as an anti-apoptotic protein to prevent the apoptosis induced by doxazosin. Data from the present study will be useful to develop cancer therapeutic methods including apoptosis-related gene manipulation and protein inhibition in the prostate cancer.