원거리 허혈양상화가 흰쥐의 심장근육에서 NOS와 Akt 발현에 미치는 영향

Abstract

원거리 허혈양상화는 생명유지와 밀접한 관련이 없는 장기에서 짧은 허혈과 재관류를 반복하는 과정으로, 심장의 기능 장애에 의한 허혈손상을 감소시킨다고 알려져 있다. 허혈과 재관류시 생성되는 산화질소는 심근경색 후 심장의 기능을 조절하는 중요한 인자이다. 산화질소합성효소(nitric oxide synthase, NOS)는 산화질소의 합성에 필요한 효소로, nNOS와 iNOS, eNOS 등 3 종류의 이형이 알려져 있다. 원거리 허혈양상화는 iNOS를 감소시키고 eNOS를 증가시키며, 세포보호 단백질로 알려진 Akt를 활성화시켜 심장근육세포를 보호한다고 알려져 있다. 이에 본 연구자는 원거리 허혈양상화가 흰쥐의 심장근육에서 관찰되는 iNOS와 eNOS, Akt의 발현 및 Akt의 활성화(phospho-Akt, p-Akt)에 미치는 영향을 알아보고자 본 실험을 실시하였다. 35주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰쥐를 사용하여 대조군과 원거리 허혈양상화군으로 나누었고, 원거리 허혈양상화의 횟수에 따라 3회와 6회, 10회군으로 나누었다. 원거리 허혈양상화는 왼온엉덩동맥을 흰쥐용 혈관집게를 이용하여 5분 허혈과 5분 재관류를 반복하여 실시하였다. 실험동물을 재관류 0시간과 3시간, 6시간, 24시간, 72시간에 경추탈골로 희생시킨 다음 심장을 적출하여 iNOS와 eNOS, Akt, p-Akt의 면역조직화학염색과 Western blot 분석을 시행하여 다음과 같은 결과를 얻었다. 1. iNOS의 발현은 원거리 허혈양상화에 의하여 증가되었으며, 10회군에서는 3회와 6회군보다 증가되었다. 2. eNOS의 발현은 원거리 허혈양상화에 의하여 증가 또는 감소되었으며, 횟수에 따른 eNOS 발현의 차이는 없었다. 3. Akt의 발현은 원거리 허혈양상화 후 재관류 24시간과 72시간에 감소되었고, 횟수에 따른 Akt 발현의 차이는 없었다. 4. p-Akt의 발현은 원거리 허혈양상화에 의하여 증가되었으며, 횟수에 따른 p-Akt 발현의 차이는 없었다. 이상을 종합하면, 흰쥐 뒷다리에서 실시한 원거리 허혈양상화가 세포보호단백질인 eNOS와 p-Akt를 증가시켜 심장근육의 세포를 보호하나, 10회 이상의 원거리 허혈양상화 후 증가되는 iNOS와 심장근육의 손상은 밀접한 연관이 있을 것으로 생각된다.; Remote ischemic preconditioning, brief tolerating cycles of ischemia and reperfusion in remote non-vital organs, can reduce ischemic injury of the heart. Nitric oxide (NO) generated during ischemic-reperfusion phase is an important modulator of cardiac performance after myocardial infarction. Nitric oxide synthases (NOS) catalyze the conversion of L-arginine to NO and L-citrulline. Remote ischemic preconditioning induces cardiac protection by down-regulating iNOS or up-regulating eNOS. Also, Akt, a key protein of cell survival, has been known to protect myocardium after ischemia-reperfusion. The purpose of this study was to observe the expression of iNOS, eNOS, Akt and phospho-Akt (p-Akt) in the rat myocardium after remote ischemic preconditioning. Thirty-five weeks-old male Sprague-Dawley rats were divided into control and remote ischemic preconditioning (IP) groups. The IP group was further subdivided into 3 groups based on the number of cycles of IP. For IP, left commom iliac artery was occluded 3, 6 and 10 times for 5 min of ischemia alternating with 5 min of reperfusion using rodent vascular clamp. The animals were sacrificed at 0, 3, 6, 24 and 72 hours of IP and the heart were removed. The expression of iNOS, eNOS, Akt and p-Akt in the rat myocardium was examined with immunohistochemical methods and Western blot analysis. The results were as follows; 1. The expression of iNOS was increased by IP. It was higher in 10IP groups than 3IP and 6IP group. 2. The expression of eNOS was increased or decreased by IP. It was showed no difference with increasing episode of IP. 3. The expression of Akt was decreased by IP, at 24 and 72 hours after reperfusion. It was showed no differences with increasing episode of IP. 4. The expression of p-Akt was increased by IP. It was showed no difference with increasing episode of IP. These results suggest that hind limb ischemic preconditioning provide cardiac protection through up-regulation of eNOS and phosphorylation of Akt, but overexpression of iNOS after excessive episodes of remote preconditioning may have close relation to the myocardial injury.