국내 환자 검체에서 분리된 Escherichia coli와 Klebsiella pneumoniae에서 플라스미드 매개성 퀴놀론 내성 유전자의 검출 및 특성 분석

Abstract

서론 : Fluoroquinolone은 β-lactam 항생제와 더불어 환자의 치료에 널리 이용되는 항생제이다. Fluoroquinolone계의 항생제의 사용이 증가하면서 내성균 또한 전세계적으로 크게 증가되었다. 퀴놀론 항생제 내성은 이 약제의 표적 효소인 topoisomerase II (DNA gyrase)와 topoisomerase IV 유전자의 변이에 의하여 주로 발생하지만 최근 플라스미드로 매개되는 퀴놀론 내성 유전자가 발견되었다. Qnr 유전자는 플라스미드 매개성 퀴놀론 내성을 일으키는 유전자로서 DNA gyrase와 topoisomerase IV의 활성을 억제하여 nalidixic acid와 fluoroquinolone계 항균제의 내성을 4배에서 8배 증가시킨다. 다른 전파성 퀴놀론 내성 유전자로서 aac(6')-Ib-cr이 최근 보고되었는데 이는 aminoglycoisde acetyltransferase를 코딩하는 aac(6')-Ib 유전자의 변이 유전자로서 ciprofloxacin의 piperazinly amine 기를 N-acetylation시켜서 ciprofloxacin의 감수성을 2-4배 감소시킨다. SHV-5, SHV-7, CTX-M-15와 VEB-1등의 ESBL과 DHA-1등의 plasmid-mediated AmpC β-lactamases (PABL)을 생산하는 균주들에서 qnrA-like-양성균주들이 발견되었으며, 최근에 SHV-12와 qnrB 유전자의 연관성이 보고되었다. 이번 연구의 목적은 1. 국내 환자 검체에서 분리된 ESBL 혹은 PABL을 생산하는 E. coli와 K. pneumoniae에서 플라스미드 매개 퀴놀론 내성 유전자의 빈도를 확인하고 2. 이들 유전자와 β-lactamase 유전자의 연관성을 연구하며 3. 플라스미드 매개 퀴놀론 내성 유전자가 fluoroquinolone의 MIC에 미치는 영향을 파악하고자 하였다. 실험방법 : 각각 다른 기간 동안, 서로 다른 기관에서 수집 한 균주로서 ESBL 혹은 PABL을 생산하는 E. coli 115균주와 K. pneumoniae 193균주를 대상으로 하였다. 유전자-특이 중합효소연쇄반응과 제한효소 분석으로 qnrA, qnrB와 aac(6')-Ib-cr 유전자를 검색하였다. qnrA-양성 3균주, qnrB-양성 8균주, aac(6')-Ib-cr-양성 3균주의 PCR 증폭산물을 염기서열 분석하였다. PBCSK(+)와 EcoRI 혹은 HindIII 제한효소를 이용하여 qnrB2와 aac(6')-Ib-cr 유전자를 클로닝하였고 qnrS 클론은 구입하였다. 각각의 클론을 E. coli DH10B와 Nalr 변이주인 E. coli XL10-Gold에 transformation하였다. qnrB2 혹은 qnrS와 aac(6')-Ib-cr 유전자를 동시에 포함한 균을 제작하기 위하여 aac(6')-Ib-cr 유전자를 포함하는 자연 플라스미드를 정제하여 각각 E. coli DH10B과 E. coli XL10-Gold에 transformation하였고 qnrB2 또는 qnrS 클론을 다시 transformation하여 플라스미드 매개성 퀴놀론 내성 유전자 qnr과 aac(6')-Ib-cr을 동시에 가지는 E. coli와 E. coli Nalr 변이주를 제작하였다. 결과 : ESBL 또는 PABL-생산 E. coli에서 플라스미드매개 퀴놀론 내성 유전자의 빈도는 낮았다; qnrA, 2/115 (1.7%); qnrB, 3/115 (2.6%); aac(6')-Ib-cr, 4/115 (3.5%). 반면에 ESBL 또는 PABL 생산 K. pneumoniae는 플라스미드매개 퀴놀론 내성 유전자의 빈도가 높았다; qnrB, 88/193 (45.6%); qnrA, 6/193 (3%); aac(6')-Ib-cr, 21/193 (10.8%). Aac(6')-Ib-cr 양성인 21균주의 K. pneumoniae중 9균주가 qnrB4와 aac(6')-Ib-cr 유전자를 동시에 가지고 있었고 9균주는 변이 전 유전자와 변이 후 유전자를 동시에 가지고 있었다. PABL중 DHA-1을 생산하는 균주들은 qnrB4유전자와 강한 연관성을 보였다( 75/95, 75.7%). qnrB2, qnrB4, aac(6')-Ib-cr 혹은 qnr과 aac(6')-Ib-cr가 양성인 wild type 균주는 모두 fluoroquinolone에 내성이었다. qnr 유전자를 접합으로 E. coli J53Azir에 전달하면 fluoroquinolone의 MIC가 균에 따라 4-8배 증가하였으나 aac(6')-Ib-cr 포함 플라스미드를 같은 균에 전달한 경우 ciprofloxacin의 MIC가 2-4배 증가하였다. 클론된 qnrB2나 qnrS 유전자를 E. coli DH10B에 전달한 경우 모든 퀴놀론의 MIC가 16-64 배 증가하였고 aac(6')-Ib-cr과 qnr 유전자를 동시에 전달한 경우 qnr 유전자만 있는 균주보다 ciprofloxacin의 MIC가 2배 높았다. qnr 유전자를 gyrA96 변이(Phe-> Leu)가 있는 E. coli XL10-Gold에 전달하면 ofloxacin, levofloxacin 및 moxifloxacin의 MIC는 증가되나 모두 susceptible에서 intermediate 영역에 속하지만 같은 Nalr 변이주에 qnr과 aac(6')-Ib-cr를 함께 전달하면 ciprofloxacin의 MIC가 4배 증가하여 intermediate에서 resistant 영역으로 변화되었다 (MIC 2-4 g/mL). 결론 : 국내 환자에서 분리된 K. pneumoniae에 플라스미드매개 퀴놀론 내성 유전자가 널리 분포되어있었다. 특히 DHA-1을 생산하는 대부분의 균주가 qnrB 유전자를 보유하고 있기 때문에 국내에서 DHA-1이 크게 증가하는 것으로 추정되었다. qnr은 모든 fluoroquinolone에 aac(6')-Ib-cr은 ciprofloxacin에 저도 내성을 일으키지만 두 유전자의 동시 획득은 내성의 부가효과(additive effect)를 보였고 Nalr 변이주에 두 유전자를 전달한 경우 역시 내성의 부가효과가 관찰되었다. 앞으로 국내 퀴놀론 내성 유전자의 확산에 대한 관찰이 필요하겠다.; Background Fluoroquinolone is one of the most commonly prescribed antibiotics. With the wide use of fluoroquinolones, fluoroquinolone resistance has been increased worldwide. Fluoroquinolone resistance usually occurs by mutations of topoisomerase II (gyrase) or topoisomerase IV genes. Recently, plasmid-mediated quinolone resistance genes were identified. Qnr, the gene product, is a member of the pentapeptide repeat family of proteins and has been shown to block the action of ciprofloxacin on purifed DNA gyrase and topoisomerase IV. The qnr genes increases the resistance to nalidixic acid and fluoroquinolones by four- to eightfold. The aac(6')-Ib-cr, variant of aac(6')-Ib which encodes an aminoglycoside acetyltransferase, confers reduced susceptibility to ciprofloxacin by N-acetylation of its piperazinyl amine. At the present, several qnrA-like-positive isolates expressed extended-spectrum β-lactamases (ESBL) such as SHV-5, SHV-7, CTX-M-15 and VEB-1 or plasmid-mediated AmpC enzyme (PABL) such as DHA-1. Association of qnrB and SHV-12 was published recently. The objectives of the study are to observe the prevalence of qnr genes and aac(6')-Ib-cr gene in clinical isolates of Enterobacteriaceae producing ESBL or PABL, to characterize the plasmid-mediated quinolone resistance genes, and to evaluate the impact of plasmid-mediated quinolone resistance genes to the resistance of fluoroquinolones in E. coli. Method The presence of qnrA, qnrB and aac(6')-Ib-cr was screened for 115 isolates of E. coli and 193 isolates of K. pneumoniae producing ESBL or PABL collected from different institution and different time during the period from 1998 to 2007 by each gene-specific PCR and the enzyme restriction. Each qnrA, qnrB and aac(6')-Ib-cr genes were sequenced using PCR products of 3, 8 and 3 isolates, respectively. Transconjugants of qnrB2, qnrB4 and aac(6')-Ib-cr genes were made using E. coli J53Azir. QnrB2 and aac(6')-Ib-cr genes were cloned and introduced into the E. coli DH10B and E. coli Nalr mutant (E. coli XL10-Gold). Each of qnrB2 or qnrS clone was introduced into the E. coli containing aac(6')-Ib-cr natural plasmid, and E. coli containing both qnrB2/qnrS and aac(6')-Ib-cr was constructed. The MICs of fluoroquinolones for wild types, transconjugants and cloned strains were measured. Results Prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance in E. coli isolates producing ESBL or PABL was low; aac(6')-Ib-cr, 4/115 (3.5%). However K. pneumoniae producing ESBL or PABL showed a high prevalence of plasmid-mediated quinolone resistance; aac(6')-Ib-cr, 21/193 (10.8%). Nine of 21 K. pneumoniae isolates harboring aac(6')-Ib-cr were positive both for qnrB4 and aac(6')-Ib-cr, and 9 isolates had both aac(6')-Ib and aac(6')-Ib-cr. The prodution of DHA-1, a PABL showed close association of qnrB4( 75/95, 75.7%). Wild type strains containing qnrB2, qnrB4, aac(6')-Ib-cr or both qnr and aac(6')-Ib-cr were all resistant to fluoroquinolones. Transfer of qnr genes into E. coli J53Azir by conjugation increased the MIC of fluoroquinolone by 4-8 fold, but that of aac(6')-Ib-cr increased the MIC of ciprofloxacin by 2-4 fold. Transformation of cloned qnrB2 or qnrS into E. coli DH10B increased the MIC of fluoroquinolones by 16-64 fold. Administration of both aac(6')-Ib-cr and qnr genes increase the MIC of ciprofloxacin by 2-fold compared to that of the organism containing qnr genes. Transfer of qnr genes into Nalr E. coli (E. coli XL10-Gold) with gyrA96 mutation (Phe-> Leu) increased the MIC of ofloxacin, levofloxacin and moxifloxacin, but within the range of susceptible to intermediate level. However, co-transfer of qnr and aac(6')-Ib-cr into Nalr mutant increased the MIC of ciprofloxac by 4-fold, and the level of resistance increased up to the range of intermediate to resistance (MIC 2-4 g/mL). Conclusion Plasmid-mediated quinolone resistance genes were distributed widely in the K. pneumoniae isolated from the patients in Korea. Most isolates producing DHA-1 were positive for qnrB, which were considered to influence the increase of DHA-1-producing K. pneumoniae in Korea. Acquisition of additional plasmid-mediated quinolone resistance gene or Nalr mutation showed an additive effect in resistance level of fluoroquinolone or ciprofloxacin. Further study for the epidemiology of plasmid-mediated quinolone resistance genes is warranted.