Rho GTPase 활성 억제가 인간 배아줄기세포 콜로니 형성에 미치는 영향에 관한 연구

Abstract

인간 배아줄기세포는 E-cadherin 매개 세포 연접을 통해 콜로니를 형성하여 증식한다. 이러한 세포 간 연접은 인간 배아줄기세포의 미분화 유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 형성된 콜로니를 단일세포로 분리하기 위하여 트립신 처리하면 인간 배아줄기세포의 세포 간 연접이 파괴되고 세포사멸이 유도되어 콜로니가 형성 되지 않는 것으로 알려져 있으나 기전에 대해서는 아직 밝혀져 있지 않다. 인간 배아줄기세포의 세포 연접은 E-cadherin, catenin, actin, Rho GTPase 등의 단백질에 의한 adherense junction이다. 최근 인간 배아줄기세포에 Rho GTPase의 하위 조절자인 ROCK의 억제제 Y27632를 처리했을 때, 단일세포 분리 후 생존성을 향상시켜 콜로니를 형성을 촉진한다는 보고가 있었다. 본 연구는 Rho, Rac 및 Cdc42의 하위 조절자를 억제하는 것이 인간 배아줄기세포의 생존성 향상을 촉진하는지 확인하고자 수행하였다. Rho, Rac, Cdc42의 하위 조절자 중 ROCK, PI3K, Par6를 선정하고 ROCK의 억제제인 Y27632, HA1077, PI3K 억제제인 LY294002 그리고 Par6 억제제인 Aurothioglucose를 선정하여 실험을 수행하였다. 억제제 전 처리 후 트립신을 사용하여 단일세포로 만든 후 지지세포 위에서 배양하였다. 그 결과 억제제를 처리한 세포는 처리하지 않은 세포에 비해 콜로니 형성률이 약 5배 이상 증가되었으며 미분화 세포 비율의 유지가 90% 이상이었다. 그러나 억제제를 처리하지 않고 트립신만 처리 한 세포에서는 약 50%의 세포가 자연분화 상태를 보였다. 이와 같은 결과는 트립신이 E-cadherin 분해를 유도하여 세포 간 연접을 파괴함으로서 콜로니 형성 및 생존성에 영향을 미치는 것으로 추정된다. 결론적으로 Rho GTPase의 하위 조절자의 억제는 일련의 신호전달 과정을 통해 세포의 연접 재생을 촉진함으로서 인간 배아줄기세포의 생존성을 촉진하고 미분화를 유지하는데 기여 하는 것으로 사료된다.; human embryonic stem (hES) cells sustain growth and expansion by colony formation through E-cadherin-mediated cell-cell adhesion. The adherence junction is important to survive hES cells and maintain pluripotency. When the cell to cell connection is disrupted by trypsinization, efficiency of colony formation from single cell is extremely low. However the mechanism of forming colony from single hES cell is not clear. Adherence junction is composed of Rho-family GTPases, β-catenin, α -catenin, actin filaments and others. ROCK (Rho-associated kinase), as one of the downstream effectors of Rho GTPases, plays a pivotal role in the control of cell movement, cell polarity, and cell differentiation. Recent report suggests that application of a selective ROCK inhibitor, Y27632, to hES cells markedly diminishes dissociation-induced apoptosis, increases hES cell survival. In this study, to identify each colonies, after blocking activities of Rac, Cdc42, and Rho with its inhibitors (Y27632, HA1077 as a ROCK inhibitor, LY294002 as a PI3K inhibitor and Aurothioglucose as a Par6 inhibitor), and complete dissociation with trypsin, hES cells were plated on feeder layer for colony formation. As a result, the inhibitor-treated hES cells increased 5 folder efficiency of colony formation compare with untreated-hES cells. Also, Oct3/4 positive colony (95%) substantially increased after treatment with inhibitors. When hES cells are treated with trypsin, the cells may not form undifferentiated colonies because of disrupting cell to cell adhesion. These results show that inhibition of Rho GTPase control signal transduction pathways in hES cells may maintain undifferentiated state by controlling E-cadherin-mediated cell-cell adhesion. These findings suggest that hES cells form colony after recovery E-cadherin-mediated cell-cell adhesion.