Retroviral cDNA library를 이용한 급성 백혈병 유발 유전자 검색.

Abstract

급성백혈병은 조혈모세포가 종양화되어 림프구 또는 골수 세포의 비정상적인 증식이 정상의 골수 조직이나 조혈모세포를 대신하게 되어 발병을 하게 된다. 이 실험은 oncogene, homeogene, kinase, phosphatase를 이용하여 이들이 생쥐에서 급성백혈병의 발병에 어떠한 역할을 하는지 알아보는 것이 목적이다. Oncogene, homeogene, kinase, phosphatase는 세포의 분화, 성장, 각종 대사를 관여하는 세포내의 중요한 신호전달자이기 때문에 이들 유전자를 이용한 실험을 진행하였다. 유전자가 생쥐의 골수세포에 유입하여 백혈병을 유발하게 할 수 있게 하기위해 이들의 모두 MSCV retroviral vector에 새롭게 디자인하였고, 또한 유세포분석기로 쉽게 측정할 수 있도록 GFP marker 유전자를 포함시켰다. 이로 인해 총 oncogene 80개, Homeogene 30개, kinase 229개, phosphatase 99개의 MSCV retroviral cDNA library를 구축하였고, 이들을 각 유전자 별로 섞어 4개 그룹의 library를 만들었다. 이중 oncogene library를 이용하여 생쥐에서 급성백혈병 발병에 관여하는 유전자를 확인하였다. Retroviral oncogene library를 생쥐의 골수세포에 감염시키고, 이를 5마리의 생쥐에 이식하였다. 그 결과 5마리 모두에서 백혈병이 유발되었는데, 모든 생쥐에서 c-Myc을 포함하고 있었다. 이중 한 마리만이 c-Myc 혼자 발현이 되었으며, 나머지 4마리에서는 PDGFβ와 RAB3D, RAB7B, PIM2, CRK와 PIM2가 c-Myc과 함께 공동발현을 하고 있는 것을 확인하였다. 최초 생쥐에 이식한 골수세포가 레트로바이러스에 10.56%가 감염되었는데, 이로 인해 하나의 골수세포에서 두개의 레트로바이러스가 감염되는 일은 희박한 일이다. 그럼에도 불구하고 2개의 유전자가 공동으로 발현하고 있다는 것은 이들의 공동발현이 급성백혈병 유발을 용이하게 하거나 가속화하는 것으로 해석된다. 이를 직접적으로 확인하기 위해서 c-Myc은 NGFR marker 유전자를 포함한 MSCV retroviral vector로 새롭게 디자인하였고, c-Myc과 위의 oncogene들이 실제로 급성백혈병 유발에 상승작용이 있을 것이라 예상된다.; Acute myeloid leukemia is a disease caused by oncogenic change(s) of hematopoietic stem cells or progenitor cells. The purpose of this research is to thoroughly characterize the gene involved in the leukemogenic processes by screening the retroviral cDNA libraries of cellular oncogenes, homeobox genes, kinases genes, and phosphatase genes. These four categories of genes were chosen for their significant roles in signal transduction and cellular transformation. The cDNA libraries were constructed by cloning the individual genes to a MSCV retroviral vector backbone. For convenience of detecting the transduced cells and their protein products, the MSCV retroviral vector was modified to include HA tag and GFP marker and eighty cellular oncogenes, 30 homeobox genes, 229 kinase genes, 99 phosphatase genes were individually cloned and the structural integrity was verified. The first screen for the leukemia-inducing genes were performed using the cellular oncogene library. For this 5-FU treated mouse bone marrow cells were transduced with retroviral mixtures of oncogenes, and the cells were transplanted into five mice that were lethally irradiated. All five mice developed acute leukemia between the eight and ten weeks post-transplantation. The oncogenes that were responsible for the leukemia induction were characterized by genomic DNA PCR of the leukemic cells of each mouse. All five mice had c-myc genes in their leukemic cells. However, except for a single mice, he mice have additional oncogenes within the leukemic cells and the list of the additional genes include; RAB3D, RAB7B, PDGF-beta, CRK, and PIM-2. Since the initial transduction rate of 5-FU-treated bone marrow just prior to in vivo transplantation was 10.56%, it is highly unlikely that all these additional oncogenes were present in the transplantable leukemic cells just by chance. We are currently verifying the cooperativity of these genes with c-myc in inducing leukemia in the same animal model.