항 AK3 마우스 항체의 당쇄 제거에 의한 혈장 단백질과의 비특이적 결합의 억제

Abstract

치료용 항체 개발은 제약 시장에서 가장 빠르게 성장하고 있는 분야 중 하나이다. 현재 20여 종의 치료용 항체가 FDA의 승인을 받아 판매 중이고, 150여 종의 치료용 항체가 임상 승인을 기다리고 있다. 항체는 치료, 진단, 생명공학연구 등에 다양하게 활용될 수 있다. 하지만 항체의 임상적 활용에 있어 제반 문제점은 항체와 비특이적으로 결합하는 단백질이 혈액에 존재하며, 이들이 항체와 결합함으로 항원 인식능의 저하, 항체의 면역학성 유발 등이 발생한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 다양한 형태의 항체 공학의 발전을 가져오게 했다. 선행연구에 의해 AK3가 심근경색의 진단 마커로의 가능성을 제시하였으나 위에 언급한 문제점이 역시 발생하였다. 이에 본 연구에서는 AK3 특이적 단클론 항체와 혈청 내 단백과의 비특이적 결합을 배제하는 방법으로 항체의 당쇄를 화학적으로 제거하여 심근경색증 의 체외 진단 에 적용하여 평가하였다. 당쇄의 제거는 PNGase F라는 효소학적 제거에 의해 수행 하였으며, MALDI-TOF-MS를 통해 당쇄가 제거된 항체와 그렇지 않은 항체간의 분자량 peak를 비교하여 당쇄 제거 여부를 확인 하였다. 당쇄 제거 결과 항체의 고유 특징인 항원-항체의 해리상수 값도 증가함을 보였고, 당쇄 제거 항체는 그렇지 않은 항체와 비하여 현저하게 혈청 내 단백질과 비특이적 결합을 배제 할 수 있었다. 또한 이러한 화학적 조작을 통해 작성한 항체를 체외진단 시스템에 적용한 결과, 혈청 내 항원의 탐지 한계도는 0.25 ng/ml까지 향상되었으며, signal to noise ratio 역시 향상되었다. 이상의 결과로 항체의 당쇄 제거는 항체의 활용 목적에 따라 매우 유용한 역할을 나태 낼 수 있을 것임을 제시하였다.; Therapeutic antibodies represent one of the fastest growing areas of the pharmaceutical industry. There are currently 20 monoclonal antibodies in the market that have been approved by the FDA and over 150 in clinical developments. Antibodies can be applied to therapy, diagnosis and research of biotechnology broadly. But, clinical application of antibodies has the problem that the proteins in the host blood caused non-specific binding to foreign protein, antibody. Therefore, non-specific binding may resulted in the un-wanted noise in diagnosis and antigenicity therapeutics. To solve these problems, antibodies have been engineered by a variety of methods. Previously, we reported that mitochondrial matrix form isozyme of AK (AK3) could be used as a diagnostic biochemical marker for Myocardial Infarction (MI). However, as the human plasma contains the broad range of proteins that bind to murine antibody non-specifically, the selected Mab pair showed low sensitivity in diagnosis of MI by ELISA. In order to increase the signal-to-noise ratio, we focused on interference of N-linked glycans of antibody. Deglycosylation of Mab was performed enzymatically by incubation with PNGase F at 37°C for one week. Removal of N-inked glycans was verified by MALDI-TOF-MS. As the results, antigen-antibody affinity was improved slightly. And using the native Mab pairs, the detection limit of the AK3 in human serum was 4 ng/㎖, but was improved up to 0.25 ng/㎖ by removal of glycans from the Mabs. In conclusion, deglycosylation of antibodies reduced the non-specific binding of serum proteins thus can reduced the false positive signals in diagnostic assays. Also, this result might be applied for the further applications in antibody therapy.