생쥐 방광에서 Estrogen에 의한 밀착결합과 Aquaporin 발현 조절

Abstract

상피세포에 존재하는 밀착결합 (tight junction, TJ) 복합체는 세포사이의 공간을 통한 입자들의 이동을 제한하는 확산장벽 (paracellular permeability barrier)의 기능과 막내입자들의 분포와 자유로운 이동을 제한함으로서 상피세포를 관강측과 기저측으로 구분 짓는 펜스기능을 수행한다. 밀착결합은 occludin, claudin 등의 integral membrane protein과 ZO-1 등의 plaque protein으로 구성되며 세포질 내부로 세포질골격 및 다양한 신호전달 분자와 복합체를 형성하고 있으므로 다양한 세포 내외부의 신호에 반응하여 그 구조와 기능이 역동적으로 조절된다. 세포막에 존재하는 다양한 ion 및 solute transport protein들 이외에도 aquaporins (AQPs) water channels이 동물의 다양한 조직에 존재하며 세포를 통한 수분와 glycerol, urea, CO2등 저분자 물질의 이동에 관여한다. AQPs을 경유한 세포막의 내외로 한 대량의 수분이동은 수동수송 기작의 하나이며, 삼투압을 저하시키는 방향으로 작동한다. 방광상피 umbrella cell (UC)에 존재하는 밀착결합과 AQPs은 혈액-뇨 확산장벽으로 작동하며, 수분 이동에 관여한다. 따라서 신장에서 생성된 암모니아성 소변의 농축과 수분과 다른 분자들의 이동 저장에 중요한 기능을 담당한다. 다양한 조직에서 밀착결합과 AQPs의 발현은 난소스테로이드 호르몬에 의해 조절된다. 본 연구에서는 생쥐 모델로 방광의 발달과정 동안 밀착결합 유전자인 occludin, claudin-1, -2, -3, -5, -11, JAM-1, -2, -3, AQP-1, -4, -5, -7, -8, and -9의 발현을 분석하고, 난소절제 암컷의 방광에서 이들 유전자발현이 미치는 에스트로젠의 효과를 분석하였다. Fetus (GD19), neonate, 1, 8주령의 수컷 생쥐의 방광에서 total RNA를 분리하여 정량적 RT-PCR법으로 상기 유전자 mRNA 발현을 분석하였다. claudin-1, -2, -5, and -11의 mRNA 발현은 1주령까지 증가하다가 성체에서 감소하였고, claudin-3 and occludin mRNA 발현은 neonate와 성체에서 높은 반면 fetus와 1주령에서는 낮았다. 또한 claudin-3, JAM-2, and -3의 발현은 neonate에서 가장 높았다. AQP 4 and 7의 mRNA 발현은 ferus에서부터 점점 감소하는 것을 확인하였고 AQP 5 and 8 mRNA 발현은 neonate와 성체에서 높은 반면 fetus와 1주령에서는 낮았다. 또한 AQP 1 and 5의 발현은 neonate에서 가장 높았고 AQP 9의 발현은 fetus에서 1w까지 감소 하다가 성체에서 가장 높았다. 면역조직화학적 방법으로 TJ 단백질 발현부위를 분석한 결과 UC과 subumbrella cell (subUC)에서 cla-1, cla-11, JAM-1, -3 , and AQP 8 발현이 강하게 나타난 반면 occludin, JAM-2, AQPs 는 muscle에서 발현이 강하였다. 1주, neonate, fetus의 미분화된 상피세포에서도 유사한 발현양상을 보였다. 성체 (8주령)의 암컷 생쥐 (체중: 25g)에 난소절제술(OVX, ovariectomized)을 시행한 후 17beta estradiol(E2)을 sesame oil에 용해하여 0.3mg/mouse를 주사하고 24시간 후 방광을 분리하여 이들 유전자발현을 분석하였다. Estrus(발정기), 난소절제술(OVX) 시행군, OVX-E2 투여군의 암컷 생쥐의 방광에서 정량적 RT-PCR법으로 밀착결합 유전자 발현 (mRNA) 분석결과 estrus와 비교했을 때 OVX군에서는 claudin-1, -11, occludin, JAM-1, -2, AQP-1, -4, -5, -7, -8, and -9발현은 감소하는 반면 JAM3는 증가하였고, estrus와 OVX-E2 투여군을 비교했을 때 cla-11, AQP-4, -7, -8, and -9은 감소한 반면, cla-11, occludin, JAM-2, and -3은 증가하였다. OVX군과 OVX 후 E2 투여군을 비교했을 때 저농도 처리군에서는 증가하였고 E2 고농도로 처리군에서는 모두 감소하였다. 이로부터 방광상피의 분화 과정에서 밀착결합을 통한 물질의 이동이 차등적으로 조절됨을 암시한다. 출생 후 수유가 시작되면서 모체의 혈액과 분리된 상태에서 수분의 흡수가 진행됨에 따라 UC의 조직학적, 기능유전체학적 분화가 진행되는 것으로 사료된다. 또한 estrogen은 방광상피조직에서 발현되는 밀착결합 유전자의 종류 및 발현정도를 조절함으로서 방광조직의 분화에 개입하고 있는 것으로 사료된다. 이는 폐경기 여성에서 방광상피의 혈액-뇨 장벽의 변화 가능성과 함께 방광염과 같은 염증성 질환에 취약한 원인기작으로 제시된다.; Epithelial tight junctions (TJs) constitute continuous, circumferential seals around cells. TJs work as a paracellular permeability barrier, which prevents free passage of solutes and water molecules through the paracellular spaces. TJs are comprise of multiple integral membrane proteins, such as occludin, claudins, plaque protein and zonula occludens-1 (ZO-1), etc. Since cellular skeleton and signalling molecule complex located in inner cytoplasm, TJs are response by various inter and outer cellular signal and control their structures and functions dynamically. Urinary bladder aquaporins (AQPs) play important roles in the regulation of urinary bladder water homeostasis and they have special functions in concentration and storage of amonian urine from kidneys. To elucidate the role, estrogen in the maintenance of urinary bladder water homeostasis, epithelial TJ and AQPs in urinary umbrella cell (UC) work as a permeability barrier for blood and urine through the paracellular spaces. Therefore, they have special functions in concentration and storage of amonian urine from kidneys. Expression of TJ and AQPs in various tissues are controled by ovary steroid hormone. To illuminate the role estrogen in the maintenance of urinary bladder water homeostasis, changes in the expression of TJs and AQPs following ovariectomy (OVX), as well as the effect of estrogen (17ß estradiol, E₂) on the expression of occludin, claudin-1, -2, -3, -5, -11, JAM-1, -2, -3 and AQP-1, -4, -5, -7, -8, and -9 in OVX urinary bladder, was examined in mice. We isolate total RNA from male bladder whose samples from Fetus (GD19), neonate, 1 week old, and 8 weeks old and quantitative RT-PCR was used for analysed expression mRNA of the genes. Results that total mRNA expression of Claudin-5, -11, JAM-2, and -3 increase due to aging, mRNA claudin-1 and -3 mRNA increase untill 1 week old and decrease due to aging, and higher expression of claudin-2, occludin, JAM-1 were found in neonate. We checked expression of TJs protein by location using immuno-histochemistry. Cla-1, cla-11, JAM-1, -3 were highly located in UC and subUC. By the way, occludin and JAM-2 were found in most of muscle in bladder. Similar expression patterns were found in pre-matured epithelial cell of 1 week, neonate, and fetus. Cyclic adult female mice were prescreened by virginal smearing and selected animals were subjected to ovariectomy. After recovery, to allow clearance of circulating estrogen following OVX or sham, mice were rested for two weeks, and then subjected to the estrogen treatment. Additionally, some OVX mice were received intraperitoneal single injection of E₂ at 0.3 or 2 mg/head dissolved in sesame oil. As a control, sesame oil was injected as a vehicle (n = 4 for each treatment). Normal cyclic mice (n = 4) were sacrificed at the estrous stage. OVX mice were sacrificed 24h after dosing of E₂. Expression of TJ and AQPs are in mice, a little increased in OVX bladder compared with estrus stages. After OVX, claudin-1, -11, occludin, JAM-1, -2, AQP-1, -4, -5, -7, -8 and -9 decreased but JAM3 increased. Compared with estrus cycle bladder and E₂ treated OVX bladder, cla-11, AQP-4, -7, -8 and -9 decreased but cla-11, occludin, JAM-2, -3 increase(increased). Compared with OVX bladder and E₂ treated OVX bladder, expression was(x) increased in E₂ high level treated group. Considering the results, while claudin-5, -11, JAM-2, -3 among TJs genes are expression types in developed epithelial cells in bladders, claudin-1, -2, -3, occludin and JAM-1 are expression types in undeveloped epithelial cells or early stage of development in bladders. The hypothesis shows that materials pass through TJs are gradually controlled during developmental stages of epithelial cells in bladders. Since lactation after giving birth which means a beginning of water intake directly not from blood of mother, histological, functional and genetical differentiation of UC starts. At the same time, the kinds and expression of TJ and AQPs genes in bladder epithelial cells are controlled by estrogen. The results stand for reasonal mechanisms of possibilities of blood and urine barriers in bladder epithelial cells and higher outbreak of inflamed diseases in women in the menopause. Together, these results suggest that expression of AQPs in female urinary bladder tissue is tightly regulated by estrogen. This is the first report on the estrogen dependent regulation of urinary bladder AQPs.