High Performance Liquid Chromatography를 이용한 human plasma에서의 furosemide의 분석방법개발과 생체이용률시험

Abstract

Handok Pharmaceutical Co, Ltd). Plasma (500 ul) was mixed with hydrochlorothiazide (internal standard, 10 ug/ml). Detection wavelength was 270 nm. The mixture of 20 mM sodium phosphate buffer and acetonitrile 80:20 (v/v) was used mobile phase. The HPLC separation was accomplished on ODC reverse HPLC column. The furosemide analyzed by a HPLC system, which consists of Shiseido UG120 C18 column (5 ㎛, 4.6 × 150 mm) and a chromatography data analysis S/W, using a isocratic mobile phase (mixture of 20 mM sodium phosphate buffer and acetonitrile 80:20 <v/v>) at 1.0 ml/min. Its sensitivity, selectivity, accuracy and precision must be adequate for the bioavailability study of furosemide and the linearity (r2 ≥ 0.9997) of furosemide was also proved in the range of 0.1 ug/ml ― 3 ug/ml. The pharmacokinetic parameters of furosemide (40 mg) tablets were measured as the follow. AUC: 2.09 ug/ml·hr, Cmax: 1.63 ug/ml, tmax: 0.89 hr, Ke: 0.23 hr- , t1/2β: 3.04 hrs; Furosemide는 여과된 Na+의 약 30%를 재흡수하는 Henle 고리의 상행각에 작용하여 Na+-K+-2Cl-의 흡수를 강력히 억제하여 대량의 요를 배출한다. 양성 이온이 소실되기 때문에 재흡수되던 magnesium과 calcium의 재흡수가 억제되어 배설이 증가한다. K+ 배설의 증가는 원위 세뇨관에서의 분비 증가에 기인된다. 사구체 여과 속도는 furosemide에 의하여 다소 감소되며, 신장 혈류량은 증가 혹은 감소된다. Furosemide에 의한 염분 배설성 이뇨 작용은 급속히 나타나며 작용지속시간은 비교적 짧다. 이뇨작용의 최고 효력이 thiazide 이뇨제보다 높고, 작용 출현이 빠르고, 소화기 계통에서의 흡수가 쉽고 또한 빠르며 흡수된 일정 부분은 혈장 단백질과 결합한다. 그리하여 이뇨작용은 내복 후 1시간 내에 나타나고, 정맥 내 주사하면 2-10분에 나타난다. 배설은 사구체 여과와 세뇨관 분비를 통해 소변으로 신속히 배설되며 반복 투여하더라도 축적 작용이 나타나지 않는다. Furosemide 정을 대상약으로 생물학적동등성시험을 수행하기 위한 혈장시료처리방법, 및 High-performance liquid chromatography (HPLC) 분석방법을 확립하였고, 생물학적동등성시험 기준 (식약청고시 제2002-60호, 2002.11.22)에 따라서 건강한 성인 9명을 선정하여 푸로세미드(furosemide, 40 mg 정, 한독약품 <라식스 정>)을 경구-투여하고 24시간 동안 채혈하여, 혈장 내 furosemide 농도를 정량한 후, furosemide (40 mg)정의 AUC, Cmax, tmax, Ke, 및 t1/2β 등 약동학적 지표들을 다음과 같이 산출하였다. 1. ODC-역상 HPLC column (5 um, 4.6 mm×150 mm)을 사용하는 단상-역상 HPLC 방법으로 혈장 furosemide 농도를 정량분석하는 혈장 시료처리방법 및 HPLC 분석조건들을 확립하였다. 혈장 시료의 처리를 위하여 피험자로부터 각 시간별로 채취하여 -20℃에 보관했던 혈장 시료를 실온에 방치하여 녹인 후 진탕한 다음 이 혈장을 0.5 ml씩 취하여 10 ml centrifuge tube에 옮기고 여기에 내부표준물질 (internal standard : I.S)인 hydrochlorothiazide (10 ug/ml) 50 ul와 0.2 M glycine buffer(pH 0.9) 0.3 ml 및 ethyl acetate 3 ml를 혼합하여 3,000 rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액 2.5 ml를 취한다. 상등액 2.5 ml를 -60℃ nitrogen에서 evaporate하여 완전히 건조시킨 후에 mobile phase 0.5 ml를 정용한 후 teflon fiter(pore size: 0.4 um)에 걸러 20 ul를 HPLC에 주사하여 분석한다. 분석기기 조건은. 펌프는 Waters 515 HPLC pump을, 검출기로는 Waters 486 UV/Vis 검출기(270 nm)를, 컬럼은 Shiseido UG120 C18 (150 mm × 4.6 um, 5 um)를, 데이터 처리장치로는 dS CHROM Data Module을 설치한 personal PC를 사용하였다. 이동상으로는 acetonitrile : 20mM sodium phosphate buffer, pH4.8 (25:75, v/v) 혼합용액을 사용하고 유속 1.0 ml/min에서 정 량하였다. Column의 온도는 35℃로 설정하였다. 2. 검출한계는 0.1 ug/ml 이며 0.1 ug/ml - 3.0 ug/ml 범위에서 양호한 직선성 (r2 = 0.9997)을 나타내었다. 3. Furosemide (40 mg 정, 한독약품 <라식스 정>)의 각 약동학적 지표들은 AUC: 2.09 ug/ml?hr, Cmax: 1.63 ug/ml, tmax: 0.89 hr, Ke: 0.23 hr- 및 t1/2β: 3.04 hrs 등으로 산출하였다.; The present study is to determine of sensitive furosemide analysis method using HPLC and measure the pharmacokinetics parameters (bioavailability, Cmax, Tmax, Ke, T1/2) of furosemide (40 mg, Tab