Annexin V와 phosphatidylserine 결합의 공초점 현미경 이미징을 통한 세포고사의 정량 분석

Abstract

세포고사(apoptosis)는 많은 정상적인 세포의 작용에서 중요한 역할을 하는 프로그램화된 세포의 죽음 과정이다. 특정약물의 세포고사 능력을 스크리닝함으로써 치료능력의 초기 검출과 질병 진행의 평가를 가능하게 한다. 이 연구의 목적은 세포고사에 대해서 세포 이미징 분석법과 기존의 생화학적 분석법 간의 상호관계를 찾는 것이다. 보통 내부 세포막에 위치하는 PS(phosphatidylserine)는 세포고사가 유발될 때 외부 세포막으로 돌출된다. PS와 특이적 결합을 하는 annexin V의 친화력이 세포고사 관찰을 위한 매개변수로 선택되었다. 우선, annexin V와 여러 가지 몰 비율의 PS와 PC (phosphatidylcholine)로 구성된 리포좀(liposome) 간의 특이적 결합 친화도가 SPR(surface plasmon resonance)을 사용하여 측정되었다. 그 결과 PS의 몰 농도가 증가함에 따라 annexin V의 결합 수준이 비례적으로 증가함을 확인하였다. 그 후, 다양한 농도(0.01-10 μM)의 SSP(staurosporine)를 항암제로서 MCF-7 인간 유방암 세포의 세포고사를 유발하기 위해 사용하여, 세포고사 및 세포괴사(necrosis) 현상을 annexin V-FITC와 PI(propidium iodide)와 같은 형광탐침자를 이용하여 공초점현미경에 의해 관찰하였다. 세포 이미징 데이터의 형광 강도 분석을 통해 세포고사를 정량분석하였다. 기존의 생화학적 분석법(MTS 분석법 등)과 비교하였을 때, 세포 이미징 데이터는 MTS법과 유사한 결과를 나타내었고 SSP 농도에 대한 더 높은 민감도를 보인 데이터를 제공했다.; Apoptosis is the process of programmed cell death that is regulated through a tightly controlled program. Apoptosis plays an important role in many normal cellular processes, ranging from fetal development to adult tissue homeostasis. By screening the ability of apoptosis induction of a drug candidate, we would be able to evaluate its therapy efficiency and disease progression earlier. The objective of this study was to find a correlation between two different assays: a new cellular imaging assay and a conventional biochemical assay. The affinity interaction between phosphatidylserine (PS) and annexin V was chosen as a parameter for apoptosis monitoring. First, the specific binding affinity between annexin V and lipid membranes with several molar ratios of PS and phosphatidylcholine was measured using surface plasmon resonance biosensor. As PS concentration increased, the binding level of annexin V increased proportionally. Second, various concentrations (0.01-10 μM) of staurosporine (SSP) were introduced to induce apoptosis of MCF-7 cells, and the apoptotic, necrotic, and live cells were monitored using fluorescence probes such as annexin V-FITC conjugate and propidium iodide by confocal microscopy. The fluorescent intensity of the cellular imaging data was analyzed to quantify the apoptotic cells. By comparing the cellular imaging data with the colorimetric biochemical assay, i.e., the MTS assay, we found that the cellular imaging data provided similar trends in the dose-viability relationship with higher sensitivity to the SSP concentration. It can be concluded the cellular imaging technique can provide the apoptosis data much earlier than the MTS assay.