신경분화를 유도시킨 PC12 세포에서 산화성 손상에 대한 Cilnidipine의 보호효과

Abstract

고혈압 치료제로 가장 많이 쓰이고 있는 칼슘통로 차단제 중 하나인 cilnidipine의 신경보호효과 및 기전에 대한 연구로 신경증식인자(nerve growth factor)를 이용한 PC12세포의 신경분화를 유도한 후 (nPC12 세포), 산화성 스트레스에 대한 cilidipine의 보호효과 및 phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt, glycogen synthase kinase-3 (GSK-3), cytochromec, caspase-3 and poly(ADP-ribose)polymerase(PARP)을 포함한 세포 신호 전달체계(cell signaling pathway)에 미치는 cilnidipine 의 영향을 조사하였다. cilnidipine 자체의 독성을 평가하기 위하여 nPC12 세포를 cilnidipine 을 농축하여 처리하여 3,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay 와 trypan blue 염색을 시행하였으며, 150 μM까지의 농도에서는 영향을 받지 않았으나, 높은 농도에서는 감소하였다. 100 μM cilnidipine을 처리한 nPC12 세포에서는, 과산화수소만 처리한 세포에 비하여, 자유산화기가 의미 있게 감소하였으며, 100 μM cilnidipine을 함께 처리한 nPC12 세포에서는 과산화수소만 처리한 세포에 비하여 PI3K/Akt가 활성화되고 GSK-3 와 caspase-3의 활성화가 억제되며, cytochrome c가 유리가 감소되고 PARP이 분해가 감소되어서 세포가 사망하는 것을 관찰하였다. 이러한 결과는 저농도의 cilnidipine이 PI3K/Akt를 촉진시키고 GSK-3 를 억제하고 cytochrome c 의 분비 억제, caspase-3 의 불활성화, 그리고 PARP 의 분해를 저해하여 신경보호효과를 가지며, 높은 농도에서는 오히려 세포독성효과를 보인다는 것을 나타낸다. 그러므로 적정농도의 cilnidipine은 신경퇴행성질환의 산화성 세포 손상에 대한 새로운 치료전략의 가능성을 제시한다고 할 수 있다.; The effects of cilnidipine, a second-generation calcium channel blocker, on the viability of neuronal cells and cell signals, including phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)/Akt, glycogen synthase kinase-3 (GSK-3), HSTF-1, cytochrome c, caspase-3, and poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), were investigated in PC12 cells neuronally differentiated by nerve growth factor (nPC12 cells). To evaluate the effect of cilnidipine on viability, nPC12 cells were treated with several concentrations of this drug before performing 3,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assays and trypan blue staining. Free radical levels and intracellular signaling proteins were measured with the fluorescent probe 2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) and western blotting, respectively. Cell viability was not affected by low concentrations of cilnidipine, up to 150 ?M, but was slightly decreased at 200 ?M. Following 100 mM hydrogen peroxide (H₂O₂) exposure, the viability of nPC12 cells decreased significantly but treatment with cilnidipine increased the viability of nPC12 cells in a concentration-dependent manner. Treatment with H₂O₂ concentration-dependently increased the levels of free radicals in nPC12 cells, but cilnidipine treatment reduced them in a dose-dependent manner. Cilnidipine treatment increased the expression of p85aPI3K, phosphorylated Akt, phosphorylated GSK-3β, and HSTF-1, which are proteins related to neuronal cell survival, and decreased levels of cytosolic cytochrome c, activated caspase-3, and cleaved PARP, which are associated with neuronal cell death. The results indicate that a specific optimum concentration of cilnidipine has neuroprotective effects by reducing oxidative stress, enhancing survival signals such as PI3K, phosphorylated Akt, phosphorylated GSK-3β, and HSTF-1, and inhibiting death signals, including cytochrome c release, caspase-3 activation, and PARP cleavage.