사람 유도 만능 줄기세포로부터 이식 가능한 도파민 신경세포의 효율적 분화

Abstract

도파민 신경세포는 중추신경계에서 인간의 감정, 행동의 조절 등의 중요한 역할을 담당하는데, 이 중 중뇌의 substantia nigra에 존재하는 도파민 신경세포의 선택적 또는 지속적 파괴는 사지마비, 손 떨림, 경직 등의 여러 운동 장애를 주소로 하는 뇌퇴행성 질환인 파킨슨병의 원인이다. 파킨슨 병에 대한 치료법으로 L-도파 약물요법, 시상절체술 등이 실시되고 있으나, 이는 근본적인 치료법이 되지 못한다. 이 후, 파킨슨병 환자와 동물모델에서 사산된 태아의 중뇌 조직을 이식하여 개선이 되는 것을 확인하였으나 이것은 윤리적 문제와 중뇌 조직 공급의 제한이라는 한계가 있었다. 배아 줄기 세포는 다량의 세포를 얻는 것이 가능하고, 특정 자극에 의해 원하는 세포로 분화를 유도할 수 있다는 특성 때문에 세포치료의 좋은 공급원으로 생각이 되지만 이 역시도 환자와 공여세포간의 면역 부적합에 의한 면역 거부 반응이 문제가 될 수 있다. 유도만능줄기세포[human induced pluripotent stem (hiPS) cells]는 자가증식이 가능하고 분화의 유연성이 있다는 점 등 많은 특성이 배아줄기세포와 유사하며, 유도만능줄기세포로부터의 질 좋은 도파민 신경세포로의 분화가 가능하다면 이는 파킨슨병 환자들에게 환자 맞춤형 세포를 제공할 수 있는 좋은 치료방법이 될 수 있다. 우리는 선행된 연구에 의해 MS5 세포와 SHH가 과발현된 MS5 세포에 배아 줄기 세포를 공배양시, MS5 유래 stromal cell-derived inducing activity(SDIA)에 의해 배아 줄기 세포를 신경 전구 세포로 90%이상 효과적으로 분화가 됨을 보였다. 이번 연구에서는 사람 배아 줄기 세포 분화에 사용되었던 공배양 방법을 사람 유도만능줄기세포에 적용하였을 때, 순도 높은 신경전구세포로 분화가 가능한 것인가를 확인하였다. 배아 줄기 세포에서와 같이 MS5 feede와 공배양시 많은 양의 도파민 신경 세포의 생성이 가능하였고, 세포치료 가능성을 검증하기 위해 6-hydroxy dopamine (6-OHDA)를 이용하여 만든 hemi-parkinsonian rat model에 신경전구세포를 이식하였을 때, graft volume이 형성이 되고 이들에서 도파민 신경세포 표지인자들이 발현하는 것을 확인하였으며, 또 이식된 동물에서 behavior improvement를 관찰할 수 있었다. 그러나 사람 유도 만능 줄기세포에서 유래된 신경 전구 세포의 경우 그들의 성장 능력이 배아 줄기 세포에서 유래된 신경 전구 세포에서 보다 낮았으며, 역분화를 위해 사용되었던 viral transgene들이 분화가 되어도 완전히 제거되지 못함을 보였다. 또 도파민 신경세포로의 분화에 필요한 cAMP를 처리하였을 때, transgene들이 증가하는 것을 관찰하였다.; Human embryonic stem (hES) cells, derived from preimplanted embryonic blastocyst, are regarded as a desirable cell source for cell replacement therapies. In addition to safety and ethical concerns, however, clinical level of cell transplantation may require donor cells of which MHC genes are compatible to those of the recipient. In an effort to generate histocompatible stem cells, several groups have established ES cell-like pluripotent stem cells derived from human adult tissue cells by reprogramming (human induced pluripotent stem cells; hiPS cells). To test a possibility of hiPS cells in therapeutic use for Parkinson’s disease (PD) characterized by degeneration of dopamine (DA) neurons in the midbrain substantia nigra, this study aims at derivation of midbrain-type DA (mDA) neurons from hiPS cells and evaluation of the hiPS-derived DA neuron properties, functions, and safety in clinical use. Co-culture protocol with the stromal cell-line MS5 was applied on the differentiation of the hiPS cells which has been established from foreskin fibroblasts by lentiviral exogene delivery of Oct3/4, Sox2, Nanog, LIN28. Similar to hES cell differentiation, hiPS cells efficiently differentiated toward midbrain-type neural precursor (NP; hiPS-NP) cells, which in turn yielded an enriched population of mDA cells exhibiting the expressions of the markers related to the DA neuron, tyrosine hydroxylase (TH) and dopamine transporter (DAT), midbrain-specific markers engrailed-1 (En1), Nurr1, A9 midbrain DA Neuron-specific marker G-protein regulated inward-rectifier potassium channel subunit2 (Girk2). Upon transplantation, the hiPS-NP cells survived for 4 weeks of post-transplantation period, differentiated into mDA neurons which were integrated to host striatum and induced significant behavioral restorations in 2 out of 4 PD rats. Next, we compared hiPS-NP (DA) cell properties with those of NP cells derived from hES cells (hES-NP). Previous studies have shown that the proliferative and DA neurogenic properties of hES-NP cells are unaltered after long-period of NP cells expansion. By contrast, proliferation of hiPS-NP cells was sustained only for short-term period: three times after NP passages, proliferation of hiPS-NP cells were not induced with a decrease of telomerase activity. In contrast to none or slight expressions of undifferentiated markers in hES-NP cells, relatively abundant expression of the undifferentiated markers and cells expressing Oct3/4 were detected in the cultures for hiPS-NP (DA) cells. RT-PCR analyses using the primers specifically detecting the undifferentiated genes exogenously introduced showed that expressions of the exogenes were not abolished but continued after differentiation. Furthermore, the expression of exogenes were modulated by several intracellular signalings including that mediated by cAMP. Taken together, this study indicates a promising prospective of hiPS-NP cells as a source for PD therapy, but problems in cell maintenance in vitro and safety in clinical use are remained to be further solved.