금속이온 의존성 과산화물 센서인 PerR 단백질의 과산화물 인식 기작 연구

Abstract

PerR은 전사인자로서 금속이온을 이용하여 과산화물을 감지하는 센서이다. 최근 연구에 의하면 Bacillus subtilis PerR (PerRBS)은 낮은 농도의 과산화물을 감지하기 위하여 Fe 이온에 의해 촉매되는 히스티딘의 산화를 사용한다. 하지만 Staphylococcus aureus PerR (PerRSA)은 in vivo에서 Mn 이온에만 특이적으로 반응하여 전사를 조절한다는 사실이 알려졌다. 하지만 본 연구를 통하여PerRSA도 PerRBS와 마찬가지로 Fe 이온의 리간드로 사용될 것으로 추정되는 두 개의 히스티딘 잔기(His43, His97)의 산화가 일어남을 확인하였다. 또한 MALDI-TOF 질량분석기를 이용한 PerRSA의 생화학 및 돌연변이 분석을 통해 PerRSA에는 적어도 두개의 금속이온 결합위치가 존재하며, 하나는 구조적 금속이온 (Zn2+)이며 다른 하나는 조절/과산화물 감지 금속 위치임을 확인하였다. 구조적 금속이온 부위는 4개의 시스테인 잔기 (Cys102, Cys105, Cys142, Cys145)에 의해 Zn 이온이 결합된 형태를 하고 있으며 이 부위는 과산화물에 의해 쉽게 산화되지 않는 특성이 있음을 확인하였다. PerRSA단백질의 돌연변이 제조를 통해 활성을 조사함으로써, 조절/과산화물 감지 금속 부위는 5개의 N/O donor 리간드 (His43, Asp91, His97, His99, Asp110)를 갖는 것으로 추정하였다. 이러한 결과는 PerRSA가 구조적, 기능적으로 PerRBS와 유사함을 보여주며, 과산화물의 감지를 위하여 철 이온을 통한 히스티딘의 산화를 이용하는 메커니즘이 PerRSA에서도 일어남을 보여준다. B. subtlis 뿐만 아니라 다른 많은 종류의 세균에도 PerR 및 PerR 유사 단백질이 존재하지만, 이들의 과산화물 감지 메커니즘은 전혀 연구되어 있지 않다. 이들 PerR 유사 단백질들의 과산화물 감지 메커니즘을 연구하기 위해 현재까지 알려진 대부분의 PerR 단백질들을 대상으로 이들의 과산화물 감지 메커니즘을 알아보기 위한 연구를 수행하였다. 실험 대상 perR 유전자를 B. subtilis에 클로닝하여 활성을 측정한 결과 PerRSA, Listeria monocytogenes PerR (PerRLM)및 Enterococcus faecalis PerR (PerREF)은 B. subtilis 내에서도 활성을 가지는 것으로 보아, S. aureus. L. monocytogenes, E. faecalis 는 서로 공유할 수 있는 PerR 오퍼레이터 부위 및 PerR 단백질을 합성하는 것으로 보인다. 대장균에서 단백질을 과량발현 한 후 질량분석을 수행한 결과, PerRLM, PerREF, Synechocystis sp. PCC 6803 PerR, Clostridium acetobutylicum PerR 및 Streptomyces coelicolor CatR에서는 H2O2처리에 의해 철 이온의 리간드로 추정되는 히스티딘을 포함하는 펩타이드 두 개에서 16Da이 증가된 피크를 관찰하였다. 하지만, PerR처럼 금속이온을 이용하여 과산화물을 감지하는 것으로 알려진 Bradyhizobium japonicum Irr에서는 단지 하나의 펩타이드에서만 16Da이 증가함을 관찰하였으며, 기존에 PerR로 알려진 Streptococcus pyogenes PerR과 Neisseria gonorrhoeae PerR에서는 어떠한 산화된 peak도 관찰할 수 없었다. 이러한 결과들은 대부분의 PerR 단백질들이 일반적으로 과산화물 감지를 위해 히스티딘 잔기의 산화를 이용하고 있다는 것을 의미한다. 하지만 과산화물 처리에 의해 히스티딘 잔기의 산화가 일어나지 않는 PerRSP 및 PerRNG는 현재까지 PerR로 잘못알려져 왔을 가능성을 말해주며, 혹은 이들이 전혀 새로운 메커니즘에 의해 과산화물을 감지할 수도 있다는 사실을 의미한다. Fur 계열 단백질은 현재까지 여러 종류가 알려져 있다. 이들은 감지하는 금속이온의 종류에 따라 Fur (Ferric uptake regulator), Zur (Zinc uptake regulator), Mur (Magansese uptake regulator), Nur (Nickel uptake regulator)가 각각 Fe, Zn, Mn, Ni 이온을 감지하며 및 Fe 이온을 이용해 과산화물을 감지하는 PerR (Peroxide regulon repressor) 등이 알려져 있다. Bacillus licheniformis의 유전체 서열에는 3개의 Fur 계열 단백질을 합성하는 유전자인 Fur, Zur, PerR 외에 두 개의 새로운 단백질인 BL00690과 BL00950을 합성하는 유전자가 존재한다. 대장균에서 과량발현시킨 BL00690과 BL00950은 PerRBS처럼 두 개의 히스티딘 잔기를 포함한 펩타이드에서 산화가 일어났고, 순수분리된 BL00690은 4개의 시스테인 잔기에 의한 Zn 이온을 갖고 있었다. 이러한 결과는 새로운 Fur 계열 단백질이 과산화물의 감지에 히스티딘의 산화를 사용하며, BL00690은 PerRBS와 구조적, 기능적으로 유사함을 나타낸다. 하지만, 분리된 BL00690의 흡수 스펙트럼은 Fe-S cluster의 존재를 암시하며 B. licheniformis의 BL00690이 PerRBS와는 다른 구조와 기능을 갖을 수도 있음을 보여준다. 본 연구의 결과들은 현재까지 그람양성 세균인 B. subtilis에서만 알려진 금속이온을 통한 과산화물 감지 메커니즘이 그람음성 세균을 포함한 다양한 세균에서 사용되고 있음을 의미하며, 단순히 아미노산 서열의 유사성으로 인해 PerR로 분류된 단백질들이 실제로는 PerR과 다른 기능을 하는 단백질임을 알려준다.; PerR is a metal-dependent peroxide sensor which regulates the inducible peroxide stress response. Extensive studies on Bacillus subtilis PerR (PerRBS) has established that PerRBS uses Fe2+-catalyzed histidine oxidation for the sensing of low levels of peroxide. However, it has been proposed that Staphylococcus aureus PerR (PerRSA) may use different peroxide-sensing mechanism based on the observation that PerRSA is a Mn2+-specific repressor in vivo. Here, we show that PerRSA, like PerRBS, can bind Fe2+ and sense H2O2 by oxidation of two histidine residues (His43 and His97). Furthermore, biochemical and mutational analyses of PerRSA combined with MALDI-TOF MS indicate that PerRSA has at least two metal binding sites, one for the structural metal (Zn2+) and the other for the regulatory/peroxide-sensing metal. The structural metal site contains Zn2+ presumably coordinated by four cysteine residues (Cys102, Cys105, Cys142, Cys145) and this site is refractory to oxidation by peroxide. The regulatory/peroxide-sensing metal site is predicted to include five N/O donor ligands (His43, Asp91, His97, His99, Asp110). These results indicate that PerRSA is structurally and functionally similar to PerRBS and that Fe-mediated histidine oxidation is not uncommon for the member of peroxide-sensing Fur-family proteins. PerR and PerR-like proteins have been widely described in other bacteria. These proteins have highly conserved aminoacid residues predicted to bind metal ions in PerRBS. S. aureus, Listeria monocytogenes, Enterococcus faecalis, Synechocystis sp. PCC 6803, Clostridium acetobutylicum PerR and Streptomyces coelicolor CatR show mass increase of 16 Da at two tryptic peptides containing His residues upon H2O2 treatment. Bradyhizobium japonicum Irr show mass increase of 16 Da at only T6 peptide containing amino acid corresponding to His37 of B. subtilis PerR. However, Streptococcus pyogenes PerR and Neisseria gonorrhoeae PerR show no evidence of oxidation at the tryptic peptides containing His residue(s). These results indicate that S. pyogenes PerR may use different mechanisms for the sensing of peroxide, and that N. gonorrhoeae PerR may fuction as Fur based on its aminoacid sequence homology. S. aureus PerR, L. monocytogenes PerR and E. faecalis PerR functioned as active repressors in B. subtilis by regulating the expression of mrgA promoter, These data indicates that many PerR and PerR-like proteins can sense peroxide by oxidation of two histidine residues. The ferric uptake regulator (Fur) family proteins includes sensors of Fe (Fur), Zn (Zur), Mn (Mur), Ni (Nur) and peroxide (PerR). Bacillus subtilis contains three Fur homologues: Fur, Zur and PerR. However, the genome sequence of Bacillus licheniformis indicates that there are two additional Fur homologues, BL00690 and BL00950, in addition to Fur, Zur and PerR homologues. To investigate the role of these proteins, we have purified these proteins after overexpression in Escherichia coli. Purified BL00690 contained one stably bound Zn atom presumably coordinated by four cysteine residues, and exhibited oxidations at two His residues corresponding to sensor His residues of B. subtilis PerR. All these data indicates that BL00690 proteins have high structural and functional similarity to B. subtilis PerR. However, absorption spectrum of purified BL00690 protein suggests the presence of Fe coordination by thiolate unlike B. subtilis PerR, indicating the novel structure and function of BL00690 in B. licheniformis.